112 - Méthodes haut débit pour l’analyse de la signalisation par les récepteurs nucléaires

70% des tumeurs mammaires expriment le récepteur des œstrogènes ERα et leur croissance est régulée par les œstrogènes. Les anti-œstrogènes totaux tels qu’ICI 182,780 (ICI) sont prescrits pour traiter les cancers du sein ER+ avancés, mais notre compréhension de leurs mécanismes d’action demeure incomplète. ICI mène à l'ubiquitination puis la dégradation d'ERα par le protéasome, et nous avons observé qu’il induisait également sa SUMOylation. Cette modification est associée avec la répression de l’activité transcriptionnelle d’autres récepteurs nucléaires. Nous proposons que la SUMOylation d'ERα contribue à l'anti-œstrogénicité totale d'ICI, en réprimant la transcription des gènes cibles d'ERα via la modulation du recrutement de cofacteurs. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine dans des cellules MCF-7 (ER+) ont montré qu’ICI permettait une phase de recrutement d’ERα au niveau de ses séquences cibles, suivie d’une perte de liaison à l’ADN. Cette perte n’est due ni à la dégradation d’ERα, ni à une relocalisation cellulaire. L’inhibition de la SUMOylation d’ERα par la surexpression d’une deSUMOylase permet d’étendre la phase de liaison à l’ADN et déréprime l’expression de gènes cibles d’ERα en présence d’ICI. Enfin, ICI entraine une fermeture de la chromatine au niveau des séquences cibles d’ERα, ce qui suggère le recrutement d’un facteur de remodelage de la chromatine par ERα-SUMO, assurant ainsi une inhibition complète de l’expression des gènes cibles d’ERα.

LRH-1 (ou NR5A2) est un récepteur nucléaire orphelin qui joue un rôle essentiel dans la progression des cancers du sein. Bien que l'action de LRH-1 soit fortement corrélée avec la signalisation du récepteur ERα, LRH-1 est également exprimé dans les cancers « triple négatif » (TNBC) suggérant un rôle important de ce récepteur dans tous les types de cancers de sein. En effet, nous avons démontré que le programme transcriptionnel de LRH-1 dans les cellules cancéreuses est associé aux gènes impliqués dans la croissance cellulaire et la migration et corrèle avec la signature des tumeurs de grade élevé et de mauvais pronostic. De plus nos récentes analyses cistromiques révèlent que LRH-1 présente un degré de plasticité dans sa capacité de liaison à l’ADN. En effet, LRH-1 est associé préférentiellement à ERα et FOXA1 dans les cellules ERα+ et contrôle principalement les gènes impliqués dans la prolifération (CCND1, CDKN1A) et la signalisation hormonale. Cependant, dans les TNBC, LRH-1 se lie préférentiellement proche des gènes impliqués dans la migration, caractéristique de la progression des cancers associés à un mauvais pronostic. Ces données corrèlent avec les résultats obtenus in vitro montrant que l'inhibition de LRH-1 par des shRNA ou des molécules synthétiques bloque la prolifération mais aussi la migration et l'invasion cellulaire, faisant de LRH-1 une nouvelle cible potentielle pour le développement de traitements alternatifs.

Nos études ont permis d’élargir les caractéristiques fonctionnelles du récepteur des androgènes (AR). Par ailleurs, le séquençage « nouvelle génération » a redéfinit notre compréhension de la génétique des cancers. Dans le cancer de la prostate (PC), ces études ont identifié plusieurs mutations récurrentes, parmi lesquelles le gène qui code pour le AR est fréquemment ciblé. Etant donné son rôle central dans le cancer de la prostate, ces mutations pourraient rajouter au répertoire de fonctions du AR dans la tumorigènese. Nos études actuelles sur le AR ont révélé un mécanisme potentiel par lequel des nouvelles mutations d’ADN sont générées en créant un « mutator phenotype ». Nous avons identifié une nouvelle propriété de type « gain de fonction » créée par un épissage différentiel, résultant à des altérations dans le métabolisme cellulaire facilitant la mutagénèse et augmentant l’hétérogénéité des tumeurs. Etant donné que le PC est caractérisé par l’instabilité génétique et un métabolisme cellulaire altéré, nos études ont caractérisé les mécanismes par lesquels des mutations du AR peuvent favoriser un environnement mutagène et tumorigène. Ceci suggère que le contrôle de l’état métabolique permettrait de catalyser le « mutator phenotype ». En conclusion, la caractérisation des ses propriétés « gain de fonction » du AR permettront l’amélioration de notre compréhension de la progression du PC et aideront au développement de nouveaux traitements thérapeutiques.

CTCF est un suppresseur de tumeur impliqué dans la régulation épigénétique, souvent muté ou perdu dans les cancers. Ses multiples rôles au sein du noyau cellulaire rendent difficile la compréhension des effets du disfonctionnement de CTCF dans la progression oncogénique. Nous étudions ici deux rôles de CTCF apportant des éléments de réponse à cette question.

Premièrement, CTCF est modifié par l’ajout de poly-(ADP)-ribose appelé PARylation, catalysé par l’enzyme PARP1 (poly (ADP-ribose) polymerase). La diminution de la PARylation de CTCF est observée dans une importante proportion des cancers du sein à des stades avancés, mais l’impact oncogénique de cette perte est mal compris. Nous montrons ici que la PARylation de CTCF est nécessaire au processus de réparation de l’ADN via le recrutement de BRCA2 aux sites de dommages.

D’autre part, CTCF influence l’expression des gènes en établissant des frontières autour de gènes suppresseurs de tumeurs tels que p16 ou RB1. La perte de CTCF au niveau de ces frontières résulte en l’étalement de l’hétérochromatine dans des régions normalement transcrites, inhibant ainsi l’expression de ces suppresseurs de tumeur. Ici, nous montrons que la perte de CTCF peut également affecter la transcription d’oncogènes tels que SNAI1 et TGFβ2, favorisant la transformation cellulaire.

Les RNs nucléaires (RN) opèrent rarement seul; la liaison à l’ADN et le recrutement de cofacteurs nécessitent généralement la dimérisation des RNs. La composition du dimère définie la séquence liée et les signaux hormonaux qui activeront la transcription. Traditionnellement, les méthodes utilisées pour étudier ou cribler les RN les traitent de facto comme des homodimères ou monomère. Nous avons développé trois méthodes pour cribler des dimère de RN. Premièrement le BRETFect, utilise un triple transfert d’énergie de Förster entre deux RN et un cofacteurs pour déterminer comment une population de RN se comporte. Cette méthode nous a permis d’identifier un inhibiteur de sumoylation des dimères de ERα. Deuxièmement, le PCA-BRET détecte exclusivement les interactions d’un hétérodimère spécifique même si celui-ci forme une minorité des paires de RNs. Par cette approche nous avons lancé deux criblage à haut-débits qui ont identifié plusieurs nouveaux rexinoïdes ciblant RXRg-Nur77 qui pourront être développés en thérapie pour traiter la dyskinésie parkinsonienne. Finalement, nous avons remis au goût du jour une méthode consistant à changer la spécificité de liaison à l’ADN des RNs pour leur faire lier un élément de réponse hybride exogène contrôlant un gène rapporteur; en utilisant cette technique nous pouvons cribler pour des modulateurs allostériques des RNs. Ces trois méthodes permettront de développer des thérapies dimère-spécifique avec des effets tissus-spécifiques.

Le récepteur des œstrogènes ERα est surexprimé dans 70% des tumeurs mammaires. Suite à une induction à l’estradiol, ERα lie ses éléments de réponse (ERE) au niveau des séquences régulatrices de gènes cibles avec des cofacteurs pour moduler l’expression génique et augmenter la prolifération. Pour systématiquement identifier des gènes contribuant à la signalisation via ERα dans le cancer du sein, nous avons effectué un crible à l’échelle du génome dans une lignée humaine de cellules de cancer du sein luminal ER+ exprimant de manière stable un vecteur rapporteur luciférase en aval de 3 EREs (T47D-ERE3-Luc). Ce test est robuste (Z’>0.5) pour le shRNA contrôle contre ERα. Le crible primaire a identifié 1033 gènes (double-hits; 60% cut-off) régulant l’expression de la luciférase, incluant à la fois des régulateurs connus et nouveaux de la signalisation et/ou expression d’ERα. Un groupe de 615 gènes a été sélectionné pour un crible de confirmation. Nous avons analysé les transcriptomes de cellules T47D infectées avec des shRNAs validés (2-3/hit, 45% réduction du la cible) pour caractériser leur impact sur la signalisation via ERα. Les knockdowns de KAT6A (acétyltransférase) et de SMARCD2 (famille SWI/SNF) ont diminué le niveau d’expression d’ERα et mené à un profil d’expression génique similaire à celui suite au knockdown d’ERα. KAT6A et SMARCD2 sont tous 2 altérés dans un pourcentage significatif de tumeurs mammaires et pourraient contribuer à leur sensibilité aux anti-œstrogènes.

Les glucocorticoïdes (GCs) module la transcription de gènes produisant des effets anti-inflammatoires et immunomodulateurs puissants. Les GCs sont utilisés dans le traitement de certains cancers hématologiques, mais leur utilisation dans le traitement de la leucémie myéloïde aiguë (LMA) doivent être mieux caractérisés. En utilisant une approche chimiogénomique combinant le séquençage de l'ARN et le dépistage chimique des 248 échantillons primaires de LMA, nous avons identifié une association entre les mutations RUNX1 et la sensibilité aux GCs. La sensibilité aux GCs est anti-corrélée avec les niveaux fonctionnels de RUNX1 tels que déterminés par la nature des mutations RUNX1; les mutations de type perte de fonction et dominante négative conduisant à une sensibilité accrue. La régulation négative de RUNX1 peut inverser la résistance aux GCs dans des lignées cellulaires dérivées de LMA. Les valeurs d’IC₅₀ et le pourcentage de cellules apoptotiques déterminés après le traitement aux GCs étaient proportionnels aux niveaux de knockdown. Ces résultats suggèrent que RUNX1 influence la réponse aux GCs dans la LMA. Considérant que les mutations de RUNX1  sont observées dans ~10-20% des cas de LMA et représentent un facteur indépendant de risque pour la survie globale des patients, notre étude supporte l’idée que les GCs pourraient être efficaces pour le traitement de patients atteints de LMA comportant une mutation dans le gène RUNX1.

Deux tiers des tumeurs mammaires expriment le récepteur des estrogènes (ERα) et bénéficient de traitements ciblant spécifiquement l’activité de ce facteur de transcription hormono-dépendant. Le Tamoxifène (Tam) constitue le traitement standard de ces tumeurs. Cependant, malgré son efficacité, 30-50% des patientes connaitront une rechute, souvent accompagnée d’une résistance au Tam. Aux doses administrées en clinique, Tam est cytostatique. Actuellement, plusieurs essais cliniques visant à combiner des molécules chimiques cytotoxiques avec un traitement anti-hormonal sont en cours.

Notre but est d’identifier des molécules qui, en combinaison avec le Tam, induiraient la mort des cellules cancéreuses du sein ERα positives. Pour ce faire, l’objectif premier est d’optimiser un crible afin d’identifier des molécules capables d’induire la mort cellulaire en présence d’une dose cytostatique de Tam. Les « hits » ainsi identifiés seront utilisés dans des tests secondaires qui viseront à vérifier ces effets dans plusieurs lignées de cancer du sein ER+, puis à caractériser la puissance de ces composés et leur activité apoptotique. Ces résultats seront finalement validés dans un modèle animal.

La résistance aux antiestrogènes constitue un frein important au traitement des tumeurs mammaires ERα positives. Cette étude a pour but d’identifier des combinaisons de molécules qui permettraient une éradication plus efficace des cellules tumorales afin de prévenir ce phénomène de résistance.