207 - Techniques modernes d’analyse des aliments au service des consommateurs

Bien que des milliers de substances chimiques contaminent notre eau et nos aliments, les techniques d’analyse conventionnelles se concentrent principalement sur la recherche d’une liste finie de contaminants. De plus, la surveillance des contaminants se fait principalement sur les substances mères, et ne prend que rarement en compte les métabolites ou les produits de dégradation générés au cours de la cuisson/transformation alimentaire. Ces techniques ne couvrent donc qu’une fraction des risques chimiques dans les aliments. L’émergence des techniques type «omique» ont ouvert de nouvelles perspectives pour la surveillance des contaminants chimiques dans les aliments. Ainsi, en couplant la chromatographie liquide (type UHPLC) a la spectrométrie de masse haute résolution (ex : QTOF), il est possible d’enregistrer simultanément des informations type « ciblée » correspondant à des composés « connus » au moment de l’analyse, et des informations type « non ciblée » permettant des analyses plus complexes. Grace à la vitesse de scan du spectromètre de masse, il est également possible d’enregistrer simultanément des données de type MS/MS (fragmentation) pour l’identification ultérieure des structures inconnues. Au cours de cette présentation, des exemples illustreront cette nouvelle approche pour l’analyse de résidus antibiotiques dans le miel, et celle des résidus de plastifiants dans les bouteilles en plastique.

Cette présentation sera divisée en deux parties. Dans un premier temps, une méthodologie non-ciblée visant à identifier des composés spécifiques à deux types de thés sera présentée. Celle-ci utilise la spectrométrie de masse à haute résolution à temps-de-vol, TOF, pour l’acquisition de données pour des thés verts et de thés fermentés de type pu-erh. Les résultats sont ensuite traités à l’aide de logiciels de statistiques multivariées, qui permettent de faire ressortir, parmi les 10 000 composés présents dans les infusions, environ une dizaine de composés qui sont spécifiques à chaque famille. Pour les thés verts, ce sont des flavonoïdes qui sont ainsi identifiés, alors que pour les pu-erh les compositions élémentaires obtenues correspondent à des lipides. La seconde partie de la présentation fera un survol des possibilités offertes par la spectrométrie de masse à rapports isotopiques dans la détection de la fraude alimentaire. Des exemples seront fournis pour des miels et des sirops d’érable adultérés avec diverses sources de sucre.

Le ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation (MAPAQ) est responsable de la surveillance de la qualité des aliments vendus au détail ou produits au Québec. Le Ministère, via le Laboratoire d'expertises et d'analyses alimentaires, met en œuvre, entre autres, un plan de surveillance des fruits et légumes frais vendus au Québec et surveille au-delà de 500 résidus de pesticides dans plus de 30 types d'aliments différents. Certaines limitations instrumentales et méthodologiques ont été rencontrées lors du développement de cette approche multi-résidus. Pour certains types d'aliments, l'extraction QuEChERS conventionnelle a dû être optimisée. Les performances analytiques d'un parc instrumental composé de 4 GC-MS simples ont été optimisées pour permettre l'analyse simultanée d'environ 300 analytes en une seule injection. De nombreux analytes ont été ajoutés ou transférés vers la technologie LC-MS/MS afin d'assurer une sensibilité maximale. Les défis rencontrés seront discutés dans une perspective d'acquisition de nouveaux instruments GC-MS/MS et LC-MS/MS nouvelle génération prévue en 2017. De plus, l'adaptation récente d'une approche statistique permettra au laboratoire d'améliorer ses plans d'échantillonnage afin de maximiser l'utilisation des ressources disponibles. 

La canneberge contient de nombreux polyphénols qui sont responsables de la coloration rouge du fruit, mais aussi de ses bienfaits antioxydant pour la santé. Ce petit fruit est étudié par de nombreux groupes de recherche depuis quelques décennies, ce qui a permis d’en définir le profil en composés phénoliques. L’arrivé d’instruments de spectrométrie de masse de plus en plus performants permet d’augmenter la résolution et la sensibilité de détection des molécules, ce qui offre un potentiel d’identifier de nouveaux polyphénols dans la canneberge.
Notre groupe identifie par quadripôle temps de vol (LC/MS Q-TOF, Agilent 6545) la masse exacte de composés dans la canneberge. Notre base de données, de type "Personal Compound Database and Library" compte 2800 composés qui sont recherchés dans le profil par le logiciel MassHunter. Cette approche non-ciblée permet ainsi d’avoir une vue d’ensemble, et donc d’orienter les recherches sur de nouveaux polyphénols dans la canneberge.

Les composés naturels suscitent un vif intérêt auprès des consommateurs qui accordent de plus en plus d'importance à une saine alimentation. Cette tendance pousse le marché bioalimentaire à innover afin de proposer des produits sécuritaires contenant des additifs naturels en remplacement des additifs de synthèse. Les peptides antimicrobiens naturels apparaissent comme une alternative aux agents conventionnels de conservation et leur application est visée en industrie agroalimentaire, en médecine vétérinaire et humaine.

Dans ce contexte, l’identification et la caractérisation de protéines précurseurs de peptides antibactériens issus d’algues marines ont été effectuées. Les protéines solubles ont subi une hydrolyse par des protéases. Des fractions peptidiques ont été obtenues à la suite d’une filtration sur membranes. Une approche de fractionnement bioguidé combinée à une analyse en spectrométrie de masse a permis d’identifier des séquences peptidiques antibactériennes inédites d’algues brunes (Saccharina) et de les synthétiser, confirmant ainsi leur rôle potentiel dans l’activité antibactérienne. Les peptides identifiés proviendraient de différents précurseurs protéiques, telles une protéine similaire à l’ubiquitine, des histones, une protéine constituée de séquences répétées riches en leucine et une protéine ribosomique. Ainsi, ces peptides pourraient permettre de diminuer ou contrôler la croissance de microorganismes pathogènes ou d’altération dans les produits alimentaires.

Afin d’éviter les contaminations alimentaires en milieu industriel, il est important de s’assurer de l’innocuité à la fois de l’aliment, mais également des surfaces de travail et des outils utilisés lors de sa transformation puisque différents germes, incluant également le pathogène, y sont souvent déjà présents en faible quantité.

E. coli O157:H7 représente le sérotype de pathogènes le plus souvent incriminé dans les éclosions et ceci à cause de sa production de vérotoxines causant des diarrhées sanglantes et pouvant même parfois aller jusqu’au syndrome urémique.

Le but de ce projet était le développement d’un test permettant la détection rapide et spécifique de ce  pathogène particulier. Le milieu d’enrichissement a été optimisé permettant ainsi d’augmenter significativement la production de la toxine et donc parallèlement de réduire la durée d’incubation. L’optimisation de la croissance a également permis d’améliorer le signal de détection. Par ailleurs,  un matériau nanocomposite a permis la mise au point d’un test d’immunodétection spécifique d’un anticorps monoclonal dirigé vers la sous-unité B de la Shiga toxine 2. L’utilisation de modèles mathématiques a permis d’optimiser les conditions permettant une immobilisation optimale des anticorps pour une meilleure détection.

Les éléments chromosomiques et mobiles peuvent coder pour des gènes de résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds dans Salmonella enterica, ce qui améliore leur capacité à causer la maladie et transférer ces gènes de résistance à d'autres espèces bactériennes. Nous avons développé une plateforme intégré et automatique pour la séquençage des génomes bactériens capable de traiter 120 génomes bactériens entier par semaine et fournissant des statistiques sur la qualité de la séquençage, l'assemblage, l'annotation, l'identification des gènes de résistance aux antibiotiques et aux métaux lourds, les gènes de virulence et le contenu du mobilome. Le séquençage de haute qualité a été effectué en utilisant Illumina MiSeq avec des bibliothèques à paires appariées de 300 bps et une couverture de 30X donnant 30-40 contigs. De plus, nous avons développé une plateforme intégré pour l'assemblage de novo de génomes bactériens. Le séquençage génomique de plus de 3,900 souches de Salmonella enterica utilisant notre plateforme de séquençage, l'analyse du mobilome ainsi que des recherche à la fois de la bases de donnés des gènes de résistance aux antibiotiques (CARD) et la base de données des gènes de résistance aux métaux lourds (BacMet) a révélé des caractéristiques uniques comme un répertoire de gènes résistants aux antibiotiques appartenant à la plupart des classes d'antibiotiques cliniquement utiles ainsi que des gènes résistants aux métaux lourds dans des génomes de prophages.

Dans l’optique de mettre au point de nouvelles technologies de détection rapide des pathogènes d’origine alimentaire, nous avons développé une méthode d’immuno-détection utilisant une membrane à base de biopolymère comme support de détection de L. monocytogenes. Ces travaux ont permis premièrement de mettre au point un test ELISA en sandwich, spécifique à une séquence unique (le peptide D) de la protéine p60 impliquée dans la croissance et dans la pathogénicité de L. monocytogenes. Puis dans un deuxième temps, nous avons réussi à  favoriser l’expression de la protéine p60 de L. monocytogenes de plus de 50% après 9 heures de croissance dans un milieu d’enrichissement sélectif dont la concentration en dextrose a été modifiée. Le support à base de polymère a également été développé et optimisé dans le but de permettre aux anticorps de capturer spécifiquement la protéine p60 de L. monocytogenes durant sa croissance dans le milieu modifié. L’utilisation de ce support de détection dans le milieu modifié permet, après seulement 36 hrs d’incubation au lieu de 48 hrs, de détecter la protéine p60 dans un échantillon de surface alimentaire contaminé avec L. monocytogenes à une concentration de 3 log (seuil de croissance non détectable). Ainsi, la capture de la protéine p60 de L. monocytogenes en seulement 36 heures de croissance représente une avenue potentielle pour la mise au point d’une méthode de detection rapide et spécifique de L. monocytogenes en milieu industriel alimentaire.

L’objectif de l’étude était de détecter les facteurs génétiques de virulence et d’antibiorésistance d’Escherichia coli, isolés de salades de légumes crus prêt à l’emploi, en restauration collective. Un total de 218 E. coli ont été détectés. Le profil de résistance aux antibiotiques a été déterminé par diffusion en gélose et détection des supports génétiques de résistance. La prévalence dans les salades de légume des E. coli présentant des gènes de virulence était de 37,2%. Les pathovars sont répartis en E. coli Enterotoxigène (ETEC, 23,4%), Enteropathogène (EPEC, 2,8%), Shigatoxinogène (STEC, 0,9%) et Enteroagregatif (EAEC, 8,7%). La prévalence d’E. coli résistants aux antibiotiques était de 70,2% avec 28,4% de multi résistants. L’antibiorésistance concernait majoritairement la tétracycline (52,3%), et la streptomycine (38,5%). Les gènes aaa [3]-IV, CIMT, QnrA, tetA, tetB, cmlA et cat1 conférant respectivement la résistance à la gentamicine, ampicilline, quinolones, tétracycline et chloramphénicol ont été détectés. Des mesures de maîtrise sanitaire de pathovars d’E. coli résistants aux antibiotiques sont nécessaires.

Mots clés : Salades de légumes, Escherichia coli, antibiorésistance, restauration collective