Introduction spécifique et efficace de la mutation ponctuelle c.8713 C>T dans l’exon 59 du gène DMD en utilisant la technologie CRISPR Cas9 Prime editing

La Dystrophie Musculaire de Duchenne est une maladie héréditaire létale causée par des mutations dans le gène DMD. Les approches de traitement existantes permettent des améliorations phénotypiques limitées. Cette étude visait à mesurer la capacité du Prime editing à introduire la mutation c.8713C>T dans l’exon 59 du gène DMD. Cette technologie utilise un plasmide PE2 constitué d’une Cas9n fusionnée à une transcriptase inverse et un plasmide contenant un pegRNA constitué d'un ARN guide, une séquence d’amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse permettant de remplacer tout nucléotide par n’importe quel autre nucléotide. Plusieurs pegRNA ont été conçus pour introduire la mutation c.8713C>T à la position +13 du site de coupure par la Cas9. Les cellules HEK293T ont été cotransfectées par les deux plasmides et 72 heures plus tard, l’exon 59 a été amplifié et séquencé par la méthode Sanger. Le taux d’édition a été estimé par le logiciel EditR. La modification a été détectée dans 7% des séquences. L’utilisation supplémentaire d’un guide provoquant une coupure à +62 du site de coupure initial, et une mutation de la séquence PAM, a permis d’obtenir 10% d’édition. Des mutations synonymes autour de la mutation d’intérêt ont permis d’augmenter le taux d’édition à 39%. Le Prime editing a permis d’introduire la mutation c.8713C>T dans le gène DMD et pourrait être un excellent outil pour corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD pour une expression de la dystrophine.