103 - Génétique humaine

La Dystrophie Musculaire de Duchenne est une maladie héréditaire létale causée par des mutations dans le gène DMD. Les approches de traitement existantes permettent des améliorations phénotypiques limitées. Cette étude visait à mesurer la capacité du Prime editing à introduire la mutation c.8713C>T dans l’exon 59 du gène DMD. Cette technologie utilise un plasmide PE2 constitué d’une Cas9n fusionnée à une transcriptase inverse et un plasmide contenant un pegRNA constitué d'un ARN guide, une séquence d’amorçage et une matrice pour la transcriptase inverse permettant de remplacer tout nucléotide par n’importe quel autre nucléotide. Plusieurs pegRNA ont été conçus pour introduire la mutation c.8713C>T à la position +13 du site de coupure par la Cas9. Les cellules HEK293T ont été cotransfectées par les deux plasmides et 72 heures plus tard, l’exon 59 a été amplifié et séquencé par la méthode Sanger. Le taux d’édition a été estimé par le logiciel EditR. La modification a été détectée dans 7% des séquences. L’utilisation supplémentaire d’un guide provoquant une coupure à +62 du site de coupure initial, et une mutation de la séquence PAM, a permis d’obtenir 10% d’édition. Des mutations synonymes autour de la mutation d’intérêt ont permis d’augmenter le taux d’édition à 39%. Le Prime editing a permis d’introduire la mutation c.8713C>T dans le gène DMD et pourrait être un excellent outil pour corriger des mutations ponctuelles dans le gène DMD pour une expression de la dystrophine.

Le syndrome CHARGE est une maladie génétique rare caractérisée par une combinaison complexe d’anomalies. Le modèle de souris Toupee, portant une mutation dans le gène Fam172a, récapitule le syndrome CHARGE et a pour particularité d’arborer un vaste éventail d’anomalies oculaires. En effet, en plus du colobome oculaire (fermeture incomplète de l’oeil) emblématique du syndrome CHARGE, Toupee présente de la microphtalmie (œil de taille réduite) et de l’anophtalmie (absence visible d’oeil). De plus, du pseudo-ptosis (affaissement des paupières) a pu être observé et serait le symptôme d’énophtalmie (rétrusion de l’oeil dans l’orbite) sous-jacente. Finalement, la déplétion des cellules ganglionnaires s’ajoute à la liste des défauts oculaires identifiés jusqu’à présent chez Toupee, inscrivant FAM172A parmi les régulateurs du développement oculaire.  

Parallèlement, de précédentes expériences ayant démontré que FAM172A lie AGO2, Toupee a été croisé avec le modèle Ago2cKO, engendrant des souris portant les mutations pour ces deux gènes. Ces souris portent un taux accru de colobome et de microphtalmie, validant l’interaction entre les deux gènes lors du développement de l’oeil. Grâce à des coupes histologiques, les premiers signes d’anomalies oculaires ont été identifiés au 11e jour embryonnaire. Une analyse transcriptomique à ce stade a permis d’identifier des voies de régulation probables via lesquelles FAM172A et AGO2 contrôleraient l’expression des gènes du développement oculaire. 

Le syndrome CHARGE est une maladie génétique rare dont l’acronyme correspond aux anomalies initialement associées à ce syndrome - Colobome oculaire, défauts cardiaques (Heart defects), Atrésie des choanes, Retard mental et de développement, anomalies Génitales et défaut aux oreilles (Ear defects). Depuis, de nombreuses autres se sont ajoutées. Or, les patients atteints de ce syndrome présentent des combinaisons hautement variables de ces anomalies, rendant ardu l’obtention d’un diagnostic exact et, conséquemment, une prise en charge optimale. 

L’étude d’organismes modèles a permis d’identifier certains des éléments modulant l’expressivité du syndrome CHARGE. Tout d’abord, deux modèles de souris portant des mutations sur Fam172a et Chd7 - des gènes associés à ce syndrome - ont chacun été caractérisés dans deux fonds génétiques différents (FVB et B6). Cette étude a permis d’identifier l’influence du gène pathologique, mais également de la génétique propre à chaque souche sur la nature des anomalies développées. Ensuite, divers agents ont été administrés à des souris gestantes, démontrant la grande sensibilité des fœtus CHARGE à leur environnement et, par conséquent, l'incidence de l’alimentation maternelle sur le développement du syndrome. Finalement, des expériences menées chez la souris et le ver (C. Elegans) suggèrent que des mutations causant l'inactivation complète de Fam172a engendrent, étonnement, des individus sains via un mécanisme de compensation.