118 - La biologie structurale à la croisée de la biologie et de la médecine moléculaire

Un grand nombre de peptides et de protéines sont reconnus pour leur capacité à s'auto- assembler en fibres amyloïdes, dont leur déposition tissulaire est associée à des maladies dégénératives, telles que le diabète de type II (T2D) et la maladie d'Alzheimer. Le mécanisme d’auto-assemblage de polypeptides amyloïdogéniques a été étudié par divers techniques dont la plus répandu à ce jour est un essai basé sur un marqueur fluorescent, la thioflavin T, qui se lie aux fibres amyloïdes. Cependant, cette technique est insensible à la formation d'oligomères. Nous proposons de développer une nouvelle méthode de détection. Cette méthode repose sur un marqueur fluorescent, la Fluorescein Arsenical Hairpin (FlAsH), dont l’émission de la fluorescence est amplifiée suite à sa liaison à un motif tetra-cystéique. Ainsi, une unité monomérique possédant deux cystéines pourra entrainer la reformation de l’épitope tetra-cystéique lors de son oligomérisation. Dans notre étude, nous nous sommes intéressés à l'auto-assemblage de l’islet amyloid polypeptide (IAPP), dont l’agrégation en dépôt amyloïde est associée au T2D. En utilisant les cystéines natives dans la région N-terminale de l’IAPP, nous avons pu suivre l’auto-assemblage de l’IAPP. Par cette méthode, nous avons été en mesure de déterminer que l’IAPP ne forme pas d’oligomères stables pendant la phase de latence ce qui renforce l'hypothèse d'un mécanisme de polymérisation nucléée.

La peptidase de préséquences mitochondriales (MPP) est une métallo-endopeptidase qui coupe les séquences d’adressages N-terminales de la majorité des protéines mitochondriales encodés par le génome nucléaire. Les mutations présentes dans MPP et ses substrats sont impliquées dans plusieurs maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP). Un des substrats impliqué est PINK1 – une kinase dont plusieurs mutations causent la MP autosomique précoce. C’est un fait établi qu’un knock-down de la sous-unité catalytique de MPP cause l’accumulation de PINK1 sur la membrane mitochondriale externe (MME) et la mitophagie subséquente. À cet égard, MPP est un point de jonction crucial pour la régulation de PINK1, et par conséquent le contrôle de la qualité des mitochondries. Toutefois, le site de clivage de MPP sur PINK1 et la conformation de PINK1 pendant sa protéolyse restent encore inconnus. Nous avons commencé à caractériser la MPP humaine pour comprendre les mécanismes de protéolyse concernant PINK1 et les autres substrats neuronaux associés avec la neurodégénérescence. Nous avons produit et purifié le dimère MPP  par un système de co-expression dans E. coli. Nous avons aussi développé une méthode de spectrométrie de masse pour quantifier l’activité de MPP, en utilisant la malate déshydrogénase comme contrôle positif. La caractérisation de l’interaction entre MPP et PINK1 dans le contrôle de la qualité mitochondriale se poursuit dans notre laboratoire.

La maladie de Parkinson se caractérise par une neurodégénérescence ciblant particulièrement les neurones dopaminergiques de la substantia nigra. Une hypothèse courante expliquant la mort de ces neurones est centrée sur l’incompétence du réseau de contrôle de qualité mitochondriale causée par des mutations dans des protéines clé de ce réseau; notamment, PINK1. En tant que kinase, sa propre phosphorylation est nécessaire à son activation. Mon projet de recherche est axé sur l’importance de l’autophosphorylation de la sérine 205, un résidu se situant en amont de l’hélice αC de tcPINK1 (l’homologue de PINK1 dans Triboleum castaneum), afin de phosphoryler l’ubiquitin et le domaine Ubl de Parkin. Les mutants S205A et S205N de tcPINK1 générés perdent leur capacité à phosphoryler l’ubiquitin, et les données de Spectrométrie de Masse (MS) des mutants montrent qu’ils sont moins autophosphorylés en moyenne par rapport au WT. Pour examiner l’importance globale de l’autophosphorylation de tcPINK1, la kinase a été traitée avec une phosphatase (CIP) afin de la déphosphoryler, pour ensuite comparer sa capacité de phosphoryler l’ubiquitin avec la kinase sans CIP (préphosphoryler). Il reste à optimiser la réaction de déphosphorylation et d’exacerber la différence cinétique entre tcPINK1 déphosphorylé et préphosphorylé. Enfin, suivre en parallèle le taux d’autophosphorylation de la sérine 205 par MS pourra démontrer sa participation dans l’activation de tcPINK1.