128 - Nanoparticules et nanomatériaux pour la médecine

Les cellules dendritiques jouent un rôle primordial dans la transmission du virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) ainsi que dans le développement de la réponse immunitaire innée et acquise, et ce en partie grâce aux nanovésicules ou exosomes qu'elles libèrent selon leurs états d'activation. Ces nanovésicles biologiques participent étroitement à la communication intercellulaire. Ces exosomes libérés lors de la transmission du VIH-1 aux lymphocytes T CD4 peuvent affecter la viabilité des cellules avoisinantes. La voie de dissémination des exosomes converge ainsi avec celle de la capture et du transfert des particules du VIH-1. Les particules virales et les exosomes partageant des propriétés similaires telles que la taille et leur contenu protéique, lipidique et en acides nucléiques,  il est donc difficile de les distinguer. Afin de les identifier et de les purifier, nous avons adapté des méthodes au laboratoire qui nous ont permis de caractériser les exosomes et les particules virales. Plusieurs fonctions sur les exosomes restent encore énigmatiques, mais selon la littérature, les exosomes ont la capacité d'augmenter ou d'inhiber des voies métaboliques des cellules et cela en fonction de leur état d'activation.  Enfin, ces vésicules libérées dans les tissus à la suite d'une activation cellulaire peuvent aussi se retrouver dans la circulation sanguine et refléter ainsi l'activation locale. Ce qui en fait des biomarqueurs potentiellement intéressants.



Nous avons récemment démontré que les nanoparticules issue de l'assemblage in vitro de la nucléocapside d'un virus végétal et un ARN simple brin sont d'excellents modulateurs de la réponse immunitaire innée. En bref, ces nanoparticules sont capables d'induire une réponse innée à spectre large qui induit une protection envers des infection virale et bactérienne dans les poumons. Nous avons identifié le récepteur toll 7 comme étant le récepteur immunitaire capable de reconnaître les nanoparticules. Nous pouvons aussi utiliser cette technologie comme un adjuvant et bonifier les vaccins saisonniers contre la grippe. Finalement, des études en cours suggèrent que cette technologie pourrait éventuellement permettre de luter contre le cancer et les maladies chroniques.

Dans ce travail, nous avons évalué la toxicité comparative de quelques nanoparticules en mettant à contribution des expositions in vitro. Des cellules humaines, de souris, de truites et de mollusques bivalves ont été exposées à diverses concentrations de Quantum Dots ou de nanoparticules d'Ag de préparation ou de tailles diverses.  Les impacts des expositions sur la compétence des cellules ont été suivis à l'aide de différents marqueurs d'effets (cytotoxicité, cycle cellulaire, apoptose, marqueurs moléculaires, phagocytose, transformation blastique, etc.).  Les résultats obtenus nous permettent de comparer : 1- la toxicité de différentes nanoparticules et l'impact de facteurs tels la dose, la taille, etc., 2- la sensibilité de différentes espèces face aux mêmes doses de nanoparticules, 3- la réponse de différentes populations cellulaires (macrophages vs lymphocytes), 4- la sensibilité de différents marqueurs biologiques.

Les nanotechnologies sont en pleine expansion et l'utilisation grandissante des nanoparticules (NPs) dans plusieurs secteurs d'activité augmente le risque d'exposition des humains aux NPs. Il devient important de déterminer les effets  d'une telle exposition sur la santé et de comprendre le mode d'action des NPs. De telles informations sont nécessaires pour améliorer la gestion de risque et prévenir le développement de maladies reliées aux NPs. Plusieurs études rapportent des effets proinflammatoires comme mécanisme de toxicité des NPs. Les neutrophiles sont les cellules clefs de l'inflammation et, curieusement, peu de travaux étudient en profondeur les interactions NPs-neutrophiles. Nous avons récemment initié un vaste projet de recherche visant à établir le potentiel inflammatoire de plusieurs NPs in vitro et in vivo. Pour ce faire, nous étudions la physiologie cellulaire des neutrophiles humains suite à une exposition in vitro aux NPs et nous déterminons la capacité des NPs à induire une inflammation in vivo dans le modèle de la poche d'air murin. Les résultats de cette recherche nous dévoilent que les NPs agissent de façon très différente chez les neutrophiles. Alors que la NP de dioxyde de titane est extrêmement pro-inflammatoire in vivo, d'autres sont peu ou pas inflammatoires. Toutefois, des résultats récents démontrent qu'une NP qui ne possède pas d'effet pro-inflammatoire peut agir en synergie avec un autre agent, témoignant de la complexité du mode d'action des NPs

Les exosomes sont des microvésicules comprises entre 30 et 300 nm provenant du compartiment endosomal. Elles sont impliquées dans la communication intercellulaire et peuvent ainsi être retrouvées dans le plasma. Leur production varie en fonction des pathologies. Il a notamment été démontré que la production d'exosomes est augmentée en réponse au virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1). Cependant, les particules virales et les exosomes présentent des caractéristiques de taille et de composition similaires. Afin de comprendre le rôle des exosomes dans la pathologie à VIH, il est crucial d'isoler les exosomes des particules virales. Après avoir concentré les exosomes, particules virales et microvésicules du surnageant des cellules Raji/CD4 infectées ou non par le VIH-1, nous avons soumis cette fraction à un gradient de vélocité au iodixanol ou un gradient de sucrose (couramment utilisé dans l'isolation d'exosome) puis avons dosé l'activité acétylcholinestérase (ou AChE, marqueur des exosomes) ainsi que la p24 virale dans les différentes fractions recueillies. Les résultats montrent que l'activité AChE est retrouvée dans des fractions différentes de celles contenant de la p24 après utilisation du gradient de vélocité à l'iodixanol. Ces données mettent en évidence une technique permettant de purifier les exosomes d'autres particules et pouvant ainsi contribuer à la mise en place d'une nouvelle stratégie thérapeutique.

Les points quantiques (PQs) suscitent de plus en plus d'intérêt dans les domaines du marquage biologique et de l'imagerie médicale. Leur émission étroite et ajustable, leur photo-stabilité et la possibilité de les fonctionnaliser sont tous des avantages considérables par rapport aux fluorophores organiques. Nous avons comparé la photo-dégradation de PQs de type cœur/coquille, CdSe/Cd_xZn_1‑xS selon divers paramètres : la taille du cœur, l'épaisseur et la composition de la coquille et en milieu aqueux, le ligand de surface. Les expériences ont été effectuées à l'aide d'un microscope à fluorescence afin de simuler au maximum les conditions d'analyses biomédicales. L'étude a démontré qu'il est possible d'améliorer significativement la photo-stabilité des PQs en modifiant leur structure, par exemple en faisant croître une coquille. Excités à 390 ± 10 nm, les cœurs de CdSe de 2,3 nm de diamètre ne sont fluorescents qu'environ 5 min, alors que les mêmes cœurs auxquels on ajoute une coquille de Cd_0,3Zn_0,7S d'une épaisseur supérieure à 1 nm le sont près d'une heure. Le diamètre du cœur et la composition de la coquille influencent également la photo-stabilité des PQs, mais dans une moindre mesure. Plusieurs thiols hydrophiles ont été utilisés comme ligands de surface en milieu aqueux. La longueur de la chaîne carbonée, le nombre de groupements liés aux PQs ainsi que la nature du groupement libre du thiol ne semblent pas affecter la photo-stabilité des PQs.

Les nanoparticules (NPs) sont utilisées dans une vaste gamme d'applications (produits de santé, articles ménagers, produits alimentaires et médicaux). De par leur omniprésence, les effets des NPs sur la santé humaine doivent être déterminés. Il est important d'identifier le potentiel inflammatoire des NPs, d'où l'importance d'étudier leurs effetssur la physiologie des neutrophiles. Des données de notre laboratoire indiquent que deux systèmes de NPs activent les neutrophiles en inhibant notamment leur apoptose. Pour cette raison, nous croyons que ces NPs pourraient moduler leur processus de dégranulation, et ce pour les différents types de granules présents chez les neutrophiles: sécrétoires, azurophiles et spécifiques/gélatinases. Dans cette étude, nous démontrons qu'une forte concentration de TiO₂ et de CeO₂ induit la dégranulation des granules spécifiques/gélatinases, confirmée par trois méthodes: la cytométrie en flux (expression membranaire de CD35, CD63, CD66b), l'immunobuvardage de type western (MMP9, myeloperoxidase, albumine) et la zymographie (activité gélatinases). Toutefois, il n'y a eu aucun résultat concluant pour les granules sécrétoires et azurophiles. Nos résultats suggèrent que ces deux NPs (CeO₂ et TiO₂) présentent un potentiel inflammatoire de par leurs effets sur la dégranulation des granules spécifiques/gélatinases.

Les cellules endothéliales du cerveau (CEC), représentent un des principaux obstacles pour le transport des médicaments au cerveau. Cependant, en raison de leur potentiel de sécrétion et de la proximité des neurones et des astrocytes, elles offrent aussi des opportunités uniques de ciblage thérapeutique pour le traitement des maladies neurodégénératives. Dans cette étude, l'anticorps monoclonal Ri7 ciblant le récepteur de la transferrine (RTf) murin et un IgG contrôle (IgG_2A3) ont été couplés avec des quantum dots (Qdots) et injectés par voie intraveineuse chez la souris. Les animaux ont été sacrifiés à 30 min, 1 h, 4 h et 24 h suivant les injections. Des analyses de microscopie en fluorescence ont mis en évidence la colocalisation du complexe Ri7-Qdots avec un marqueur de la lame basale. L'étude de la distribution des Ri7-Qdots en microscopie électronique a démontré leur internalisation par les CEC. La présence de Ri7-Qdots a été principalement observée à l'intérieur de différentes structures intracellulaires, suggérant l'endocytose du complexe dans les CEC. De plus, des analyses de quantification ont permis de démontrer une variation du nombre des Ri7-Qdots selon le temps de sacrifice post-injection. En résumé, les résultats obtenus suggèrent fortement que le vecteur Ri7 pourrait être utilisé dans le cadre d'un ciblage thérapeutique des CEC.

Nous avons récemment démontré que les nanoparticules (NP) de dioxyde de titane retardent l'apoptose des neutrophiles humains, suggérant que d'autres NPs puissent altérer ce processus. De plus, ceci pourrait être affecté par la nature de la NP et par son diamètre. Le but est de déterminer si la NP d'argent (AgNP) affecte le taux d'apoptose des neutrophiles et de vérifier le rôle de son diamètre. Les neutrophiles isolés du sang humain, ont été incubés avec différentes concentrations de NP d'Ag de 20nm (AgNP20) et de 70nm (AgNP70) de diamètre. La toxicité cellulaire a été déterminée par la technique d'exclusion au bleu de trypan et par la libération de lactate déshydrogénase (LDH). L'apoptose a été évaluée par cytologie et la production d'interleukine (IL)-6 et IL-8 par ELISA. Aucune nécrose n'a été observée en présence de AgNP70.  Les mêmes résultats ont été observés pour AgNP20 à l'exception de ~10% de nécrose à 100µg/ml. Aucune augmentation de LDH n'a été observée. Le taux d'apoptose est similaire au contrôle lorsque les cellules sont incubées avec 10µg/ml (~45%).  Toutefois, à 100µg/ml AgNP20, le taux d'apoptose est de 81.8 ± 4.1%  vs 19.3 ± 4.8% pour AgNP70. Contrairement à l'IL-6, nous observons une forte augmentation d'IL-8 (42000 pg/ml) à 100µg/ml AgNP20 et de 2000pg/ml pour AgNP70. Nous concluons que les AgNP peuvent affecter les taux d'apoptose des neutrophiles et que des effets opposés sont induits selon le diamètre de la NP.

Dans les dernières années, des nouveaux matériaux à base de nanophosphors pour le piégeage d'électrons  ont attiré beaucoup d'intérêt en bioimagerie. Ce travail présente la synthèse des sondes luminescentes de taille nanométrique, CaS:Eu²⁺/Dy³⁺, d'une durée de vie longue, synthétisées par la méthode de coprécipitation. Le phénomène de phosphorescence nécessite la présence de défauts dans l'hôte introduisant des niveaux discrets d'énergie métastables entre la bande de conduction et la bande de valence afin de stocker de l'énergie après l'excitation UV. Cette énergie accumulée est libérée après l'irradiation en infrarouge, en obtenant une émission très intense d'une durée de vie longue dans le visible. Dans l'hôte, le Dy³⁺ induit la formation de défauts et l'Eu²⁺ donne une émission intense dans le rouge à 650 nm, reliée à la transition permise de (4f⁶5d ® 4f⁷)³ qui sera utilisable en bioimagerie. Le mécanisme de piégeage-dépiégeage a été étudié par la spectroscopie de luminescence en  mesurant le temps optimal de la charge piégée ainsi que la variation de l'émission photostimulée en temps. Les CaS:Eu²⁺/Dy³⁺ fonctionnalisées avec le thioglycérol, dispersées dans l'eau, ont l'avantage d'être d'abord chargées par les rayons UV et ensuite administrées au patient afin d'éliminer la destruction des tissus. De plus, l'excitation non invasive en proche IR à 980 nm a comme avantage de pénétrer les tissus et de photostimuler les nanoparticules par le processus de dépiégeage.

Les nanoparticules (NP) de type "oxyde-métal" sont employées dans une panoplie d'applications. Nous avons déjà documenté des effets pro-inflammatoires des NP de dioxyde de titane (TiO₂, 1-10nm) in vitro chez les neutrophiles ou polymorphonucléaires (PMN) humains. Les PMN jouent un rôle pivot dans l'inflammation. Nous avons également démontré que ces NP sont très pro-inflammatoires et provoquent une infiltration neutrophilique in vivo dans un modèle murin. Dans la perspective de poursuivre l'étude du potentiel inflammatoire des NP de TiO₂ et de présenter nos dernières observations obtenues avec les NP d'oxyde de zinc (ZnO, 1-10nm), nous exposons ici les résultats découlant d'expériences de type cinétiques et concentration-dépendantes. Au préalable, nous avons caractérisé les NP (diamètre hydrodynamique, potentiel zêta, TEM). Nous avons déterminé leur cytotoxicité (bleu de trypan, libération de la LDH), leur effet sur le cytosquelette (morphologie cellulaire, polymérisation d'actine) ainsi que sur la production d'espèces réactives oxydées. De plus, nous avons déterminé leurs effets sur d'autres fonctions importantes des PMN. Entres autres, nous présentons ici la capacité de ces NP à retarder l'apoptose des PMN, dépendante de la synthèse protéique de novo. Même si ces NP appartiennent à une même famille, nous mettons en évidence par méthodes in vitro, leurs effets parfois différents. Nous  démontrons que, contrairement au TiO₂, ZnO ne provoque pas d'inflammation in vivo.

Le contrôle submicrométrique tridimensionnel (3D) de nanoparticules (NPs) individuelles fait l'objet de plusieurs applications. Grace à des propriétés optiques remarquables, ces nanoparticules fluorescentes peuvent aussi être utilisées dans l'imagerie physique/chimique de systèmes de tailles réduites (photoniques ou des cellules individuelles). Les nanoparticules à conversion ascendante (upconverting nanoparticles, UCNPs), capables de convertir l'énergie lumineuse dans des énergies plus élevées, ont été utilisées avec succès en bio-imagerie et pour des mesures thermiques intracellulaires. La manipulation optique d'une seule NP ouvrirait la voie à des applications très intéressantes pour l'analyse intracellulaire afin de minimiser les perturbations dans l'environnement cellulaire. Cette étude met en évidence pour la première fois le piégeage optique d'UCNPs de NaYF₄:Er³⁺,Yb³⁺ (25 nm de diamètre) en utilisant un laser à onde continue de 980 nm. Le laser a deux fonctions: la création du piège optique et l'excitation de la luminescence des ions lanthanides. Le piégeage séquentiel de NPs individuelles a été démontré par l'analyse de la luminescence générée dans le piège optique. Il a été montré que le taux de piégeage et le nombre de NPs individuelles piégées sont contrôlés par la puissance du laser et la concentration de NPs. Les résultats ouvrent une voie prometteuse vers la manipulation 3D d'UCNPs individuelles pour la détection fluorescente en biophotonique

L'imagerie par résonance magnétique (IRM) est une technique d'imagerie médicale qui fournit des images de résolution et de contraste excellent. Il est pourtant parfois nécessaire de recourir à des agents de contraste exogènes pour augmenter le contraste de zones d'intérêts (ex. : tumeurs). Les particules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPM)  sont utilisées en IRM comme agent de contraste négatif car elles diminuent le signal dans leur entourage. Malheureusement, le contraste négatif pose un problème en IRM : de nombreuses sources comme des bulles d'air ou des interfaces entre tissus peuvent engendrer une perte de signal, ce qui rend difficile le repérage de zones ciblées par les agents de contraste. Le contraste positif est lui plus spécifique car il ne peut être produit que par des agents exogènes. Outre l'agent de contraste, la séquence d'imagerie utilisée affecte aussi le contraste. Des recherches ont montré qu'il est possible d'obtenir du contraste positif avec des particules SPM. Une d'entre elles, l'Off Resonance Imaging (ORI) utilise des impulsions radio fréquence sélectives en fréquence afin de n'affecter et de ne refocaliser que les protons proches des particules SPM. La séquence ORI a été validée expérimentalement mais elle reste empirique. Nous proposons une étude systématique de cette séquence via des simulations numériques. Une interprétation phénoménologique des résultats sera donnée.

L'élaboration de nanosystèmes multifonctionnels est d'importance majeure dans la biomédecine afin d'améliorer de façon significative la détection précoce des maladies et le suivi pré et post opératoire. Cette étude présente le développement d'un système nanométrique multifonctionnel pour une manipulation  bimodale dans l'imagerie optique de fluorescence (FOI)  et de résonance magnétique (IRM). Pour la construction du nanosystème, des nanoparticules à conversion lumineuse ascendante NaYF₄: Tm³⁺ Yb³⁺(UCNPs)  modifiées avec une couche de silice  ont été fonctionnalisées par la réaction «click», au moyen du complexe gadolinium-acide tetraazacyclododecane tetraacétique (Gd-DOTA) modifié avec un groupement acétylène. C'est un agent de contraste utilisé en IRM.  Le nanosystème bimodal développé combine la grande sensibilité de FOI et la grande résolution spatiale de l'IRM. De plus, l'émission des ions lanthanides (Tm³⁺/Yb³⁺) dans la région du proche infrarouge où les tissus sont majoritairement transparents, rend l'application de ces nanostructures très prometteuses pour le traitement clinique et le suivi pré et post opératoire par IRM . L'imagerie permettrait de fournir des informations en temps réel avant et après les interventions chirurgicales.

Les nanoparticules de silice mésoporeuse (MSN) sont des candidats prometteurs pour la livraison des médicaments grâce à leurs caractéristiques uniques. Le greffage du polyéthylène glycol (PEG) améliore leur biocompatibilité et leur stabilité colloïdale. La fonctionnalisation avec le DTPA(Gd) permet de suivre par IRM leur rétention sanguine et leur accumulation aux organes. Cependant, le greffage du PEG et du DTPA bloque les pores, s'accompagnant d'une diminution considérable de la surface spécifique et du volume poreux disponibles au piégeage des médicaments. Ces molécules doivent donc être greffées à la surface externe des nanoparticules sans en bloquer les pores. Des MSN de type MCM-48 ont été synthétisées et fonctionnalisées avec différents pourcentages de PEG et de DTPA. Les résultats obtenus montrent qu'une faible quantité de PEG et DTPA assure un greffage sélectif de la surface externe tout en conservant plus de 90% de la surface spécifique, du volume poreux et du diamètre des pores. Ces quantités sont suffisantes pour avoir des particules colloïdalement stables et ayant de fortes propriétés relaxométriques pour l'IRM en contraste positif (r2/r1 = 1.47). Les nanoparticules 5%DTPA-2.5%PEG-MCM ont aussi montré leur capacité à piéger l'acridine (molécule modèle) et la daunorubicine (agent anticancéreux). Ainsi, les nanoparticules développées peuvent être considérées comme des matériaux prometteurs la vectorisation de médicaments anticancéreux et leur suivi in vivo.

La thérapie photodynamique (TPD) est une technique de traitement du cancer, basée sur la combinaison d'une source lumineuse de longueur d'onde spécifique et d'un photosensibilisateur. Elle  permet de générer des espèces de l'oxygène singlet et d'induire une cytotoxicité sur les cellules cancéreuses. Actuellement, la 2me génération de photosensibilisateurs (5,10,15,20-Tetra(m-hydroxyphenyl)chlorin (m-THPC) est plus active que les porphyrines, et absorbe la lumière dans le rouge. Cependant, les bandes d'absorption du m-THPC ne sont pas dans la région optimale du proche infrarouge, ou les tissus biologiques absorbent peu. Pour augmenter la pénétration de la lumière dans les tissus, cette étude présente la fonctionnalisation avec m-THPC, de nanoparticules LiYF4:Tm3+/Yb3+ (UCNP) à conversion ascendante. Leur efficacité en TPD est démontrée par la génération de l'oxygène singlet après activation du photosensibilisateur par l'adsorption de la lumière bleue produite par les UCNPs. Dans cette approche synthétique, le m-THPC a été modifié avec l'acide 4-(bromomethyle) benzoique (MBA) pour interagir directement avec les ions lanthanides de nanoparticules. De plus, le greffage du MBA sur le m-THPC produit dans son spectre d'absorption un déplacement batchochrome, un bon recouvrement avec le spectre d'émission d'UCNPs et donc un transfert d'énergie efficace. Les études in vitro ont montré une bonne efficacité des photo-nanoparticules pour la destruction des cellules cervicales de type HeLa.

Les nanoparticules du PapMV sont des pseudo-particules virales sous forme de bâtonnets possédant des propriétés d'adjuvant vaccinal. Les nanoparticules déclenchent efficacement une réponse immunitaire soutenue envers un vaccin, protégeant ainsi contre différents pathogènes. Afin d'expliquer l'efficacité de ces nanoparticules, les propriétés physiques du PapMV ont été évaluées par diffusion dynamique de la lumière et par microscopie électronique selon différentes variables. Il a été observé que le PapMV forme des agrégats complexes sous forme d'étoiles, tout en gardant leur structure de bâtonnet, lorsque qu'il est exposé à la température corporelle d'un mammifère. Des structures complexes comme celle-ci sont facilement reconnaissables par le système immunitaire et induisent une forte réponse immunitaire. Une forme non-agrégée à température corporelle a donc été construite afin de confirmer que cette capacité était bien reliée à son effet d'adjuvant. À la suite d'immunisations, les nanoparticules non-agrégées stimulent significativement moins les systèmes immunitaires inné et adaptatif que la forme agrégée, malgré leurs très grandes similitudes. Cette observation confirme que les propriétés physiques des nanoparticules sont essentielles à leur effet adjuvant.

Les propriétés spectroscopiques très intéressantes des nanoparticules luminescentes de lanthanides leur confèrent un potentiel d'application très important dans l'imagerie médicale et la nanomédicine. L'avantage principal de ces nanoparticules est de pouvoir utiliser de faibles énergies pour l'excitation, permettant d'éviter la destruction du matériel biologique et d'éliminer la fluorescence résiduelle des protéines. Dans les nanoparticules, les ions de lanthanides (Er³⁺/Yb³⁺) absorbent la lumière infrarouge pour obtenir une émission dans le domaine du visible. Cette étude a pour objectif d'étudier les propriétés spectroscopiques des nouvelles nanoparticules fonctionnalisées avec le ligand de type pyridine. Les quatre entités phosphonates sur la fonction complexante du ligand, présentent une grande affinité pour les ions lanthanides de nanoparticules. La présence du ligand confère une bonne stabilité des nanoparticules dans l'eau. La modification des nanoparticules avec le ligand pyridine a comme résultat l'incorporation des nanoparticules dans la matrice du ligand, et l'amélioration des propriétés d'émission. Par la suite, la fonctionnalisation des nanoparticules en position para de la pyridine du ligand, par couplage covalent avec des anticorps, protéines, ou médicaments, permettra des applications de vectorisation, détection, et diagnostic.

Les stents sont des dispositifs intravasculaires servant de support mécanique pour les artères malades. Souvent faits en acier inoxydable 316L, ils peuvent corroder lorsqu'ils sont implantés, menant à la libération d'ions toxiques et à la perte des propriétés mécaniques. L'utilisation de revêtements comme barrière protectrice est une solution viable, d'autant plus qu'elle permet le greffage subséquent de molécules bioactives. Dans nos travaux antérieurs, nous avons démontré que des couches fluorocarbonées peuvent être déposées par plasma avec une forte adhérence et cohésion. De plus, nous avons montré que la couche d'oxyde naturelle du substrat en acier inoxydable, qui est à l'origine instable, peut  être modifiée afin de moduler la résistance à la corrosion du substrat recouvert. L'optimisation des propriétés de cette couche d'oxyde, supposée amorphe, requiert une caractérisation complète. L'objectif de ce travail était de caractériser l'épaisseur et la structure de cette couche aux propriétés modulées. La combinaison de diffraction d'électrons rétrodiffusés (EBSD) et d'imagerie par contraste de canalisation électronique (ECCI) a finalement permis l'évaluation qualitative de la structure ainsi que l'estimation de son épaisseur. Ces résultats étaient impossibles à obtenir par microscopie électronique à balayage (SEM), par diffraction des rayons X à angle rasant (GAXRD) ainsi que par diffraction des électrons de faible énergie (LEED).

Un conflit foeto‐maternel ou une transfusion de plaquettes sanguines chez un patient immunisé nécessite de réaliser un groupage plaquettaire du père, de la mère et du bébé ou du donneur et du receveur. Actuellement, l'unique moyen de réaliser un typage plaquettaire est la biologie moléculaire, par Polymerase Chain Reaction (PCR) SSP. C'est un processus long, couteux en réactifs et nécessitant une quantité d'échantillons parfois trop importante. Il est donc justifié d'envisager de nouveaux outils de diagnostique avec des performances améliorées. L'INL, l'EFS Rhône‐Alpes et le LN2 développent une méthode utilisant des particules multifonctionnelles biofonctionnalisées. Une première approche basée sur un sandwich particule magnétique / particule fluorescente, et un biocapteur de fluorescence, a déjà permis d'identifier une mutation génétique (SNP) avec un seuil inférieur de détection de quelques femtomoles d'acides nucléiques synthétiques. Ces travaux sont poursuivis afin d'être applicables à de véritables échantillons biologiques. La mise en oeuvre du test a été simplifiée. Chaque particule et sandwich sont analysés par cytométrie en flux, ce qui permet de caractériser leur fluorescence, leur taille et leur granularité et de mieux comprendre leur comportement. Dans ce travail, nous montrons que la combinaison d'un système de particules biofonctionnalisées et la détection par cytométrie en flux permet d'identifier de manière spécifique le gène plaquettaire HPA‐1a.

Malgré de nombreux efforts, la barrière hémato-encéphalique (BHE) reste un frein pour la pénétration des médicaments dans le cerveau et le traitement de tumeurs cérébrales et autres troubles neurologiques. Notre équipe a déjà démontré la livraison ciblée de médicaments en utilisant les nanoparticules magnétiques (NPM) dans le foie d'un animal anesthésié à l'aide du gradient de champ magnétique d'un appareil d'imagerie par résonance magnétique (IRM). À part le ciblage, les mêmes NPM peuvent être synthétisées pour devenir magnétiquement excitées dans un champ alternatif (AC). L'énergie est ainsi libérée sous forme de chaleur. L'objectif de ce projet est d'utiliser cette élévation de température (hyperthermie) pour ouvrir temporairement la BHE. Nous avons injecté les NPM dans la carotide de rats anesthésiés et observé leur localisation par IRM. Nous avons ensuite utilisé le champ AC pour chauffer les NPM et mesurer l'augmentation de la température. L'hyperthermie causée par les NPM, conduit à une augmentation de la température de 3 degrés dans le cerveau des rats. Cette élévation semble suffisante pour provoquer l'ouverture de la BHE . Des perspectives d'administration locale de médicaments pour les tumeurs cérébrales, les troubles psychiatriques et neurologiques sont envisagées.

La toxicité des nanoparticules superparamagnétiques d'oxyde de fer (NSPM) a été investiguée sur Lemna gibba exposée pendant 7 jours aux nanoparticules Fe₃O₄ (NSPM-1), Co_0.2Zn_0.8Fe₂O₄ (NSPM-2) et Co_0.5Zn_0.5Fe₂O₄ (NSPM-3) à des concentrations variant entre 12.5 et 400 μg/ml. La toxicité a été indiqué par une diminution de la teneur en chlorophylle, une détérioration de la fonction du photosystème II (PSII) et une forte production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), provoquant l'inhibition du taux de croissance basée sur le poids frais (52-59%) ou le nombre de frondes (32-49%). L'indice de performance de l'activité du PSII, le biomarqueur le plus sensible des fonctions du PSII, a diminué de 83, 86 et 79% respectivement pour NSPM-1, NSPM-2 et NSPM-3. Dans cette étude, nous avons clairement démontré que l'altération de la photochimie du PSII et la production de ROS ont significativement contribué à l'inhibition de la croissance de L. gibba. Par conséquent, cette étude suggère que les NSPM peuvent représenter un risque de toxicité pour la viabilité des plantes aquatiques.

Les mécanismes d'autoréparation utilisés par le système nerveux endommagé comprennent la régénération d'axones endommagés, et la repousse à partir des axones non endommagés des neurones survivants. Les matériaux nanostructurés, dont l'oxyde de cérium sous forme de nanoparticules, ont des propriétés anti-inflammatoires et neuroprotectives. Bien que le système nerveux central soit principalement incapable de régénérer les axones, il permet, avec le système nerveux périphérique, la repousse collatérale.  Dans cette étude, nous avons utilisé un paradigme bien connu afin d'évaluer la repousse des nerfs nociceptifs myélinisés et non-myélinisés de la peau. La repousse est mesurée par l'expansion progressive des champs mécano-nociceptifs (sensibles au pincement) et thermo-nociceptifs (sensibles à une sonde de température) suite à un isolement résultant du « dé-nervement » de la peau adjacente. La repousse est engendrée en grande partie par l'augmentation des facteurs neurotrophiques (nerve growth factor) en particulier, sécrétée par les cellules de Schwann et des fibroblastes, qui, à leur tour, sont régies par les macrophages. Nous avons constaté que l'oxyde de cérium inhibe l'hyperactivité des macrophages et module l'effet des lipopolysaccharides bactériens (LPS) sur la repousse. Ces résultats suggèrent que l'oxyde de cérium pourrait être un agent nanothérapeutique efficace pour le système nerveux endommagé.

Ces dernières années, l'utilisation des nanoparticules (Nps) d'or (Au) pour des applications biomédicales a connu une forte croissance. Ceci est principalement dû à leurs propriétés optiques, de radiosensibilisation, et de plasmonique. De plus il est relativement aisé de greffer à leur surface différente molécules à usage biologique ou biomédical. Cependant, tous les aspects de biocompatibilité et de cytotoxicité des Nps n'ont pas été effectués à ce jour. En particulier l'éventuelle injection vasculaire des Nps d'Au pose la question de l'interaction entre les globules rouges et les surfaces d'or Dans cette étude, un test hémolytique a été effectué en mettent en contact une solution de globules rouges avec des Nps d'Au. Les Nps d'Au fonctionnalisées par le poly (éthylèneimine) (PEI) ont été utilisées. Le PEI est un polymère chargé utilisé pour le transfert de gènes. La modification de surface des Nps par le PEI a été réalisé par une procédure d'échange de ligand entre le PEI et le CTAB utilisé comme agent de surface lors de la synthèse des Nps d'Au. En mesurant la quantité d'hémoglobine libérée lorsque les NPs fonctionnalisées par le PEI sont en contact avec les globules rouges et en comparant celle-ci avec un échantillon complétement hémolysé, aucune de rupture de la membrane des globules rouges n'a été constatée. Ce test relativement simple, pourrait être introduit pour la validation du potentiel de toxicité de nanoparticules injectées de façon intravasculaire.

Les nanoparticules d'alliage or-argent (AuAg) présentent un pic plasmonique (pic d'absorption et de diffusion de la lumière) dont la position varie en fonction de la composition. Cette propriété remarquable peut être mise à profit dans le cadre de l'imagerie biomédicale. Nous cherchons à démontrer la possibilité de coupler l'imagerie Raman amplifiée par la surface (SERS) et la microscopie en champ sombre en utilisant les nanoalliages comme agent de contraste. Nous présentons ici différentes stratégies de fabrication des nanoparticules d'alliage AuAg. Nous présenterons également la modélisation des propriétés optiques des nanoalliages en fonction de leur taille et de leur composition ainsi que la caractérisation expérimentale associée. Entre autres, le pic de résonnance des nanoalliages varie linéairement avec la composition, entre le pic de l'argent pur (~400nm) et celui de l'or (~520nm). De façon similaire, l'amplification Raman par la surface des nanoparticules est dépendante de la longueur d'onde d'excitation. Nous avons également démontré qu'il est possible de différencier des nanoalliages de 3 compositions différentes sur une même image de microscopie en champ sombre. Les nanoalliages présentent donc un bon potentiel comme agent de contraste en imagerie biomédicale.

Les nanoparticules de silice mésoporeuse (MSNs) sont parmi les nanomatériaux biocompatibles les plus prometteurs pour les applications de marquage cellulaire et de livraison de médicaments. Ils démontrent une très bonne stabilité colloïdale et une porosité de l'ordre de 60-70 %. Afin de suivre par imagerie leur distribution dans l'organisme, ainsi que d'intégrer les données de leur diffusion dans des modèles pharmacocinétiques, il est essentiel de les marquer. Par exemple, un marquage au Gd permet d'observer un rehaussement du signal sanguin en IRM et ainsi établir le temps de rétention sanguine des MSNs. Un marquage à l'aide d'un radio-isotope (e.g. le ⁶⁴Cu pour la tomographie par émission de positons, TEP) permet quant à lui d'établir de façon quantitative la biodistribution des MSNs. Dans le cadre de cette étude, des MSNs ont été fonctionnalisées avec des molécules de DTPA et marquées avec du Gd et du ⁶⁴Cu (demi-vie : 12.7 h). La chromatographie d'exclusion stérique (SEC) a été utilisée comme moyen de purification rapide. Le diamètre hydrodynamique des nanoparticules correspond à 258 nm ± 95 et le rapport des relaxivités r₂/r₁ est de 1.86. Cette valeur, ainsi que les images IRM et TEP de la solution confirment l'effet de rehaussement du signal en IRM et la chélation du ⁶⁴Cu. Finalement, une étude de biodistribution TEP dans le modèle de la souris a été réalisée et a permis de confirmer le fort potentiel de ces particules pour des applications cliniques.

Plusieurs travaux ont rapporté le potentiel neuroprotecteur du curcumin. Cependant, son efficacité in vivo est limitée à cause de sa faible absorption. Nous nous proposons de comparer son efficacité suite à son encapsulation dans des nanoparticules. L'effet neuroprotecteur sera analysé vis-a-vis de l'acroléine, un produit dérivé des lipides oxydés très réactif, dont la toxicité sur les neurones et sa présence dans le cerveau des patients atteints de la maladie d'Alzheimer (MA) ont été démontrées. Les nanoparticules  ont été synthétisées tel que décrit précédemment. La caractérisation a été faite par diffusion dynamique de lumière laser (DLS) et par microscopie électronique. Les tests de mortalité (LDH) et de survie (résazurine) cellulaires ainsi que la détermination de la production des espèces oxygénées réactives (EROs)  par DCF-DA ont été effectués après traitement par l'acroléine. Certaines protéines impliquées dans les voies de signalisation cibles ont ensuite été étudiées par Western blot. Nos résultats montrent un effet protecteur du curcumin (10 µM) à travers une réduction de la production des EROs et la modulation des voies de signalisation comme le NF-ƙB, Nrf2, Sirt1, et AKT qui sont impliquées dans la survie cellulaire et dans la MA. Les tests de toxicité révèlent une plus grande protection du curcumin encapsulé par rapport au curcumin seul. Ceci confirme l'intérêt accordé aux nanoparticules comme stratégie d'administration des médicaments applicable dans la MA.

Les nanoparticules (NPs) d'oxyde ou d'hydroxyde de fer peuvent être utilisées en imagerie par résonance magnétique, afin de rehausser le signal vasculaire. Dans ce projet, des NPs magnétiques de très fines tailles (<10 nm) à base de fer sont synthétisées avec une méthode de réduction par plasma. Simple et rapide (t<5 min), cette technique consiste à projeter un plasma d'argon à la surface d'une solution aqueuse contenant des ions métalliques et des molécules de ligand. La synthèse de NPs directement dans l'eau est avantageuse en vue d'applications biomédicales. En effet, cela permet de supprimer l'étape fastidieuse de changement de ligand normalement requis avec les méthodes de synthèses de NPs pour des applications biologiques. La taille des NPs a été mesurée par microscopie électronique (TEM) et diffusion dynamique de la lumière (DLS). Les propriétés physico-chimiques ont été mesurées par spectroscopies XPS et FTIR. Une fois nettoyées par chromatographie ou par dialyse, les propriétés relaxométriques ont été mesurées (r₁=0,54 mM^-1s^-1, r₂=0,77 mM^-1s^-1, r₂/r₁=1,43). Le rapport r₂/r₁ inférieur à 5 indique que la suspension de NPs permet d'obtenir un contraste positif en IRM. Finalement, ces NPs ont été injectées in vivo (modèle de la souris), permettant de démontrer un fort rehaussement de signal vasculaire. Cette technologie pourrait avantageusement être appliquée dans les centres hospitaliers, afin de produire un agent de contraste biocompatible sur place et sur demande.

Il est établi que dans la maladie d'Alzheimer (MA), le stress oxydatif (SO) contribue à sa physiopathologie de façon précoce. De nombreux travaux indiquent que le curcumin, composé ayant une forte activité antioxydante, serait prometteur dans le traitement de la MA. Cependant, ses bénéfices sont limités par sa faible solubilité, réduisant ainsi son absorption par voie orale. Dans le but d'augmenter sa biodisponibilité, nous avons synthétisé des nanoparticules intégrant le curcumin (Nps-cur), biodégradables et biocompatibles. Ainsi, l'objectif de notre étude est de déterminer l'effet protecteur des Nps-cur contre le SO induit par le peroxyde d'hydrogène (H₂0₂) sur des cellules de neuroblastome humain, les SK-N-SH. Les Nps-cur sont synthétisés par émulsion évaporation de solvant. Elles sont caractérisées par diffusion dynamique de la lumière, par microscopie électronique et par microscopie confocale. Finalement, nous avons étudié leur toxicité cellulaire (LDH et résazurine) et leur effet sur la production intracellulaire d'espèces réactives à l'oxygène (ROS) via DCF-DA. Les Nps-cur sont non-toxiques pour les cellules SK-N-SH. De plus, leur perméabilité neuronale et leur effet neuroprotecteur sont supérieurs à ceux du curcumin seul. Les Nps-cur représentent donc une stratégie prometteuse dans le transport de médicaments dans le but de protéger les neurones contre le SO observé dans la MA.

Les nanoparticules mésoporeuses de silice possèdent des propriétés uniques pour des applications biomédicales. Il est possible de contrôler la taille des particules et des pores, de fonctionnaliser leur surface et d'améliorer leur biocompatibilité. Le dépôt de ces particules sous forme de couches minces permettrait l'obtention d'une surface poreuse, pouvant être fonctionnalisée et utilisée pour l'élution de médicaments. Le greffage de fonctionnalités permettrait leur visualisation en imagerie médicale.  Le contrôle de l'épaisseur des couches, de leur mode d'assemblage, et de leur force d'adhésion, doit être maitrisé. Peu d'études ont porté à ce jour sur le contrôle des paramètres de dépôt des couches minces de silice mésoporeuses. Dans ce projet de recherche, les nanoparticules ont été synthétisées par voie sol-gel. Elles ont ensuite été déposées sur des substrats de silice par trempage-retrait en atmosphère contrôlée. La vitesse et la température du traitement thermique après dépôt ont été variées. Les couches obtenues ont été caractérisées par microscopie électronique à balayage. La vitesse de dépôt optimale est de 0.1 mm/s. Une diminution du volume des nanoparticules, et une augmentation de la distance entre celles-ci, a été mise en évidence sur les dépôts frittés à plus de 500^°C. Les couches minces mésoporeuses développées dans ce projet pourront être utilisées pour des applications de livraison de médicaments, d'imagerie médicale, et d'ingénierie tissulaire.

Les nanoparticules (NPs) sont utilisées comme agent de contraste, pour la livraison de médicaments, etc. Les réponses biologiques en présence des NPs résultent des interactions qui dépendent de leurs propriétés physico-chimiques,  du milieu biologique et du phénomène d'adsorption de protéines qui forment une couche protéique appelée « corona ». Les études qualitatives et quantitatives de ce corona sont encore rares, mais nécessaires pour comprendre comment ces interactions peuvent être contrôlées, afin que le potentiel des NPs puisse être pleinement exploité et utilisé de manière  sécuritaire. Nous nous proposons de comprendre le mécanisme d'adsorption des protéines et d'établir une corrélation entre leurs caractéristiques physico-chimiques et leur biocompatibilité. Ainsi, plusieurs techniques de caractérisation biologique et de surface ont été utilisées pour évaluer la réponse des cellules épithéliales aux NPs d'oxyde de fer.  Nous avons démontré que la présence du corona réduit l'agglomération des NPs. Nous avons également observé que la réponse cellulaire dépend des types des protéines adsorbées. Ces résultats montrent qu'au-delà d'une caractérisation physico-chimique, une compréhension de l'effet des milieux de culture, du sang et d'autres fluides biologiques, qui peuvent entrer en contact avec les NPs, est cruciale pour l'évaluation du potentiel toxique réel en nanotoxicologie.

Les nanoparticules de MnO, de très petite taille (6 nm), pourraient être utilisées comme agent de contraste positif en imagerie à résonnance magnétique (IRM) pour marquer des cellules ou molécules. Juste après synthèse, ces nanoparticules sont hydrophobes étant recouvertes d'oléate (synthèse par décomposition thermique). En vue d'application en milieu biologique, il est primordial d'effectuer un échange de ligand afin de les rendre hydrophiles, de démontrer leur stabilité en solution aqueuse et saline, de mesurer leurs propriétés relaxométriques. Dans cette étude, un nouveau dendron à base de poly(ethylène glycol)- phosphonate a été utilisé. L'efficacité de l'échange de ligand a été confirmée par spectroscopies à rayon-X (XPS) et infrarouge (FTIR). L'implication des groupements phosphonates dans l'échange de ligands, a été mise en évidence. Ces nanoparticules « dendronisées », de rayon hydrodynamique inférieur à 100 nm, ont montré une stabilité colloïdale sur trois semaines aussi bien dans l'eau qu'en solution saline. Les propriétés relaxométriques des particules ont été mesurées à 1.41T et à 37^◦C, et donnent un r₁ de 3.5 mM^-1s^-1 pour un rapport r₂/r₁ proche de 6. Les nanoparticules de MnO recouvertes de dendrons sont donc prometteuses et seront prochainement injectées dans des souris afin de s'assurer d'une part qu'elles ne sont pas retenues par un organe vital et d'autre part qu'elles sont bien excrétées par voie hepatobiliaire ou urinaire (étude de biodistribution).

Les récents progrès en nanotechnologie ont conduit à l'élaboration des nanoparticules magnétiques (NMs) d'oxyde de fer, notamment de magnétite (Fe₃O₄), pour l'administration de médicaments, l'imagerie par résonance magnétique (IRM), la réparation des tissus, l'hyperthermie et de séparation de cellules. Récemment, une alternative intéressante à ces NMs synthétiques, appelées magnétosomes, a été découverte dans les bactéries magnétotactiques. La synthèse des magnétosomes par un processus biologique promet des avantages en termes de contrôle de la taille, morphologie, et de comportement superparamagnétique à température ambiante. Notre projet vise à livrer du monoxyde d'azote (NO) anti-biofilms via des NMs afin de prévenir les infections nosocomiales reliées aux implants. Dans ce travail, afin de choisir les NMs appropriées,  nous avons comparé les propriétés physico-chimiques, morphologiques et magnétiques des NMs d'oxyde de fer à celles de magnétosomes extraits de souches bactériennes de type Magnetococcus sp. MC-1.  Les techniques utilisées pour la caractérisation et la comparaison de leurs propriétés ont été: TEM, FTIR, VMS et XPS.

Les neutrophiles sont les premières cellules recrutées au site d'une lésion, qui peut être causée soit par des molécules endogènes (urate cristallisé) ou exogènes (nanoparticules). Elles possèdent des granules qui contiennent des enzymes capables de lutter contre les pathogènes. La calprotectine, connue pour être libérée par ces cellules en réponse aux cristaux d'urate, participe activement au développement de la réponse inflammatoire. Par ailleurs, les nanoparticules technologiques (NPT) sont des éléments de plus en plus utilisées dans divers domaines. Leurs effets sur la réponse immunitaire innée sont cependant peu connus. Dans ce contexte, le projet de recherche consiste à comprendre les mécanismes d'action qui interviennent lors d'une stimulation des neutrophiles par les fullerènes et les nanotubes de carbone. Les résultats obtenus ont mis en évidence que les NPT utilisées sont faiblement impliquées dans la dégranulation des neutrophiles et favorisent la sécrétion de la calprotectine. L'étude a également montré que ces protéines se retrouvent dans les microvésicules sécrétoires. Leur libération est stimulée par les cristaux d'urate et par les NPT. Cette étude comparative entre les NPT et les nanoparticules biologiques, permettra d'évaluer leurs impacts potentiels sur les réponses de l'immunité innée.

La hausse de la longévité de la population induit une utilisation accrue d'implants médicaux. Ces implants peuvent être contaminés par des bactéries causant l'apparition d'infections nosocomiales (IN) qui sont un problème clinique majeur. Le traitement fréquent est  l'utilisation d'antibiotiques mais ils n'ont actuellement peu d'effets sur les bactéries (résistance). De plus, elles ont la capacité à former un biofilm lorsqu'elles sont dans un environnement hostile. En biofilm, elles sont difficiles à détruire en raison de la sécrétion d'une matrice qui rend presque impossible l'accès aux antibiotiques. La solution à ces problèmes serait l'utilisation de nanoparticules (NPs), connues pour leur toxicité antibactérienne. Ce projet vise le développement d'un traitement antibactérien des surfaces des implants  chirurgicaux pour prévenir les IN. Les NPs d'oxyde de fer (Fe₃O₄) ont des propriétés intéressantes comme leur facilité de manipulation et guidage par champ magnétique. Premièrement, l'étude de la toxicité envers des bactéries (S.aureus et E.coli) des NPs Fe₃O₄ sera étudiée. En deuxième partie, ces NPs seront fonctionnalisées par l'oxyde nitrique (NO) et une étude de toxicité sera encore effectuée après fonctionnalisation. Le NO est connu pour être un radical libre réactif, produit par les cellules inflammatoires (macrophages) et aurait des pouvoirs antibactériens importants. Les NPs serviraient de véhicule pour délivrer une dose optimale de NO pour la destruction des bactéries.