206 - Organismes vivants

Le virus herpès simplex 1 (VHS-1) infecte les cellules épithéliales des muqueuses et par la suite, il infecte les neurones sensitifs où il établit la latence. Le génome du VHS-1 est constitué d’une molécule d’ADN double brin linéaire de 152 kpb divisée en la région unique longue et la région unique courte. L’existence de séquences répétées inversées de part et d’autre de ces segments permet l’inversion de ces régions uniques par un mécanisme de recombinaison homologue menant à la formation de 4 isomères lors de la réplication du VHS-1. Nous avons montré qu’UL24 favorise la production de monomères d’ADN génomique du VHS-1. UL24 contient un motif putatif d’endonucléase de type PD-(D/E)XK spécifique des membres de la superfamille des phosphodiestérases qui renferme des recombinases. Notre hypothèse est que l’interaction d’UL24 avec l’ADN viral favorise la génération de nouveaux génomes viraux par un processus de recombinaison homologue lors de la réplication. Afin de tester cette hypothèse, des cellules Vero ont été infectées par les souches virales KOS (souche sauvage), UL24X (déficiente en UL24) et UL24XRescue (virus reconstitué). L'ADN réplicatif a été digéré par SpeI qui clive une seule fois chaque unité d’ADN génomique des concatémères viraux, puis analysé par électrophorèse à champs pulsé. Les différents isomères ont été identifiés par la taille des fragments générés. Nos résultats suggèrent qu'UL24 affecte la recombinaison homologue lors de la réplication du génome viral.

L’élongation embryonnaire, précoce et tardive, du C. elegans implique des changements au niveau des cellules de l’hypoderme. L’étape précoce est contrôlée par la contraction des câbles circonférentiels d’actine (CFBs) via la phosphorylation des chaînes légères de myosine (MLC), régulée par les kinases et phosphatases : LET-502, MRCK-1, PAK-1 et MEL-11. Les gènes codant pour ces régulateurs sont répartis en deux voies parallèles : let-502/mel-11 et pix-1/pak-1. L’élongation tardive implique pour sa part de la mécano-transduction des muscles à l’hypoderme. 

Nous avons identifié une nouvelle RhoGAP, rga-7, impliquée dans l’élongation précoce et tardive. La caractérisation moléculaire du gène rga-7 montre qu’il code pour trois transcrits, rga-7l, -m et -s, exprimés dans l’hypoderme des embryons. Ces transcrits codent pour des protéines contenant des domaines F-BAR, C1 et RhoGAP. Nous montrons que RGA-7 a une activité GAP envers CDC-42 et RHO-1 in vitro. Les études d’épistasie suggèrent que rga-7 agirait en parallèle des voies let-502, pix-1/pak-1 contrôlant la phosphorylation des MLCs et en amont ou en parallèle de wsp-1, un effecteur de cdc-42 impliqué dans la polymérisation de l’actine. Nous montrons également que RGA-7::GFP a une localisation en stries situées entre les CFBs au pôle apical des cellules de l’hypoderme. Suite à ces résultats, nous investiguons la possibilité que RGA-7 puisse contrôler la polymérisation de l’actine au cours de l’élongation.

Un défaut dans la gène codant pour la nucléotidyltransférase d’ARNt, essentielle aux eucaryotes puisqu’elle ajoute aux ARN de transfert (ARNts) la séquence cytidine-cytidine-adénosine requise pour la synthèse de protéines, conduit à un phénotype sensible à la température.  Cette mutation dans la gène CCA1 de Saccharomyces cerevisiae (levure) mène à des levures viables à 22^oC mais non à 37^oC (Shan et al., 2008).  La souche sensible à la température contient une enzyme variante avec une seule substitution d’acide aminée (le glutamate 189 est changé à une lysine).  Des analyses biochimiques et biophysiques de cette enzyme variante révèle une activité réduite et une stabilité thermique réduite comparées à l’enzyme native.  En conséquence, nous avons généré une seconde mutation supresseure (l’arginine 64 changé à un tryptophan) ayant restoré la croissance à 37^oC grâce à une hausse de l’activité de l’enzyme.

Est-ce que la réduction de l’activité de l’enzyme a été dû à une baisse de l’efficacité de l’enzyme à attirer le substrat ou de catalyser la réaction chimique ou une combinaison de ces deux?  Pour explorer ces possibilités, les kinétiques de l’enzyme seront étudiés afin de définir des paramètres (Km and kcat) pour les enzymes.

Shan, X.; Russell, T.A.; Paul, S.A.; Kushner, D.B.; Joyce, P.B.M. Characterization of a temperature-sensitive mutation that impairs the function of yeast tRNA nucleotidyltransferase. Yeast, 2008, 25, 219-233?

La présente étude s’intéresse à PtZfp1 (Populus trichocarpa Zinc finger protein 1). Un facteur de transcription de la famille Cys2/His2  isolé par double-hybride pour son interaction avec deux Mapk (Mitogen Activated Protein Kinase) et possédant un motif spécifique qui confère une fonction de répresseur.  L’objectif est ici de caractériser la fonction de PtZfp1.

L’expression du gène PtZfp1 est mesurée par PCR quantitative en réponse à différents stress et hormones. Des peupliers transgéniques sur-exprimant de manière inductible PtZfp1 non-muté ou muté au niveau de deux motifs d’intérêt sont réalisés. Outre la caractérisation phénotypique des arbres transgéniques, l’ensemble des gènes régulés par PtZfp1 sous différentes conditions sont identifiés grâce à des puces à ADN. Des inoculations avec des rouilles foliaires du peuplier sont également effectuées.

Les résultats révèlent une induction de PtZfp1 essentiellement en réponse à des stress biotiques ainsi qu’à deux hormones, le jasmonate et le salicylate. La sur-expression de PtZfp1 entraine entre autre l’apparition de nécroses foliaires et la dérégulation de nombreux gènes impliqués dans divers processus comme la réponse au stress oxydatif, la voie métabolique hormonale, l’organisation cellulaire et l’activation des Mapk. Une grande partie des gènes sont communs à ceux dérégulés par le chitosan, un éliciteur de l’immunité innée des plantes, suggérant ainsi un rôle central de PtZfp1 dans la réponse de défense du peuplier.

Le parasite Leishmania donovani (L. donovani), responsable de la leishmaniose viscérale qui peut être fatale, effectue son cycle de vie sous deux formes différentes : promastigote et amastigote. Trouver des cibles thérapeutiques afin d’enrayer ce fléau mondial est un défi que nous essayons de relever en étudiant l’impact de l’infection par L. donovani sur l’activité traductionnelle de sa cellule hôte, le macrophage. Nos données préliminaires nous ont permis de distinguer deux effets différents de l’infection selon le stade de cycle de vie du parasite, grâce à des expériences de profils polysomaux et d’immunobuvardages de type Western. D’une part, les promastigotes inhibent l’initiation de la traduction chez des macrophages murins infectés. De plus, lorsque l’un de leurs facteurs de virulence, le lipophosphoglycane, est supprimé, l’inhibition de la traduction dans les macrophages est exacerbée. À l’origine de cette inhibition : la déphosphorylation, et donc l’inactivation, du principal facteur de l’initiation de la traduction, eIF4E, détectée lors de l’infection. D’autre part, les amastigotes activent les voies de signalisation mTORC1 et  MNK/phospho-eIF4E dans leur intégralité, ce qui corrèle avec une activation de l’initiation de la traduction. L. donovani exerce donc une régulation différentielle de l’activité traductionnelle du macrophage selon son stade de cycle de vie, ce qui pourrait avoir un retentissement sur l’établissement et la progression de l’infection.

Le Lipopolysaccharide (LPS) d’E. coli est un puissant inducteur de la réponse inflammatoire et immunitaire dans les macrophages. Modèle par excellence pour l’étude des mécanismes régulant l’activation des macrophages au niveau transcriptionnel. Cependant, le rôle du LPS dans l’activation traductionnelle de ces cellules n’a pas été clairement caractérisé. Notre objectif est de déterminer si le LPS module la traduction des ARNs messagers des macrophages et de caractériser les mécanismes moléculaires. A cette fin, des lignées de macrophages humains et murins, ainsi que des macrophages primaires ont été stimulés avec le LPS et la régulation des transcrits a été observée par un marquage radioactif, l’analyse des profils de polysomes, microarray, RT-PCR et immunobuvardage. Nos résultats ont montré une augmentation de la synthèse protéique de novo, qui a lieu à l’initiation de la traduction. Ceci induit la production de cytokines pro-inflammatoires, de facteurs de transcription, de chimiokines et de molécules microbicides. De plus, le LPS active fortement les macrophages déficients en 4E-BP1/2 en augmentant la production d’oxyde nitrique et d’IL-12. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des voies signalétiques mTORC1 et MNK1/2 montre leur implication dans l’activité microbicide des macrophages induite par le LPS. Nos études visent à identifier des régulateurs traductionnels qui pourraient devenir des cibles thérapeutiques lors des réponses inflammatoires exacerbées.

Le Macacine herpesvirus 1, ou virus B (BV), est un virus de macaque très neurovirulent pour l’Homme et mortel dans 80% des cas si aucun traitement n'est administré. La protéine UL24 du virus herpès simplex de type 1 (VHS-1), dont l’hôte naturel est l’Homme, a un rôle important dans la neurovirulence et la réplication virale et est conservée parmi tous les Herpesviridae. In fine, par une stratégie d’étude comparative des protéines UL24 de ces deux virus, nous souhaitons découvrir de nouvelles fonctions d’UL24 expliquant son rôle dans la pathogenèse.

Un vecteur codant la protéine BV-UL24 a été transfecté transitoirement en cellules épithéliales de singe. Nos résultats préliminaires montrent qu'après 24h, BV-UL24, tout comme VHS-1-UL24, est détectée à travers toute la cellule (au noyau, en périnucléaire, sous forme ponctuée dans le cytoplasme et à la membrane cytoplasmique).  Par ailleurs, BV-UL24 semble induire la dispersion de la nucléoline, une protéine impliquée entre autres dans la synthèse et la maturation des ribosomes, tout comme VHS-1-UL24 induit une telle dispersion via son motif endonucléase, qui est parfaitement conservé chez BV-UL24. Enfin, bv-ul24 possède deux codons d'initiation de la traduction dans le même cadre de lecture ouvert et code potentiellement pour deux protéines.  Le rôle distinct de celles-ci, et de leurs homologues du VHS-1, sera étudié par mutagénèse dirigée afin d'avoir une meilleure compréhension du rôle de bv-ul24 dans l'infection.

Le champignon phytopathogène Botrytis cinerea est classé 2^e agent pathogène en importance au niveau mondial et présente un risque élevé de développer de la résistance aux fongicides. Aujourd’hui, la génétique des mécanismes de résistance est de plus en plus documentée et plusieurs mutations responsables de la résistance au boscalide ont été identifiées sur le gène de la succinate déshydrogénase. Il y a des outils moléculaires pour étudier ces mutations, mais ils ont leurs limites. Ils ne permettent pas d’analyses quantitatives et un grand nombre d’échantillons ne peut être traité rapidement. L’utilisation du Pyromark Q24 comme outil de détection et de quantification de cinq mutations reliées à la résistance au boscalide a permis de repousser ces limites. La technique est basée sur le séquençage par synthèse générant des données quantitatives avec une précision de 5%. Dans ce projet, deux tests ont donc été élaborés, mis au point et validés. Les résultats obtenus ont démontré une relation linéaire (R²=0.99) entre les ratios (0% à 100%) de spores d'individus résistants et sensibles analysés avec le Pyromark Q24. Cette technologie permettra donc d'analyser un grand nombre d’échantillons plus rapidement, avec une meilleure précision, et favorisera l’étude populationnelle en offrant la possibilité de combiner les échantillons. Le Pyromark Q24 est une technologie prometteuse pour mieux comprendre et gérer plus efficacement la problématique de la résistance aux fongicides.

Le but de cette étude est de cloner et de séquencer GAPC chez le pissenlit Taraxacum officinale (Asteraceae).  Ce gène appartient à la famille des gènes GAPDH qui codent pour la structure de l’enzyme glycolytique glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH; EC 1.2.1.12). Une partie du gène a été amplifiée par  la méthode de PCR à deux reprises. La première amplification a été effectuée à partir d’amorces dégénérées. Les amplicons obtenus ont été soumis à une deuxième amplification à partir d’amorces spécifiques à la région du gène qui est dépendante du NAD⁺. Des amplifications supplémentaires ont été achevées par la méthode de transformation d’Escherichia coli par l’intermédiaire du vecteur de clonage pJET1.2.  Par la suite, le gène en question a été extrait, purifié et séquencé par la méthode de Sanger. L’analyse bio-informatique de la séquence obtenue a montré qu'elle correspond à une partie de GAPC-2 composée de 859 pb et 4 régions codantes. De plus, le gène possède une homologie assez élevée (71%) au gène GAPC-2 (GenBank: NM_101214) provenant de l’arabette des dames Arabidopsis thaliana (Brassicaceae).  Le produit prédit du gène est composé de 200 acides aminés et possède une homologie substantielle (89%) au produit du gène GAPC-2 d’A. thaliana. Vue l’importance de l’enzyme GAPDH, la comparaison de la structure du gène GAPDH  chez différentes espèces de plantes locales servira à établir des liens entre l’aspect moléculaire du gène et sa signification évolutive.

Chez le Caenorhabditis elegans, la transformation d’un embryon ovoïde en une larve vermiforme est une étape d’embryogenèse tardive appelée l’élongation embryonnaire. Celle-ci implique des changements morphologiques des cellules (ventrale, latérale et dorsale) de l’hypoderme, et est divisée en deux étapes, précoce et tardive. Dans le modèle communément admis, l’élongation précoce est menée par la contraction des câbles circonférentiels d’actine au pôle apical des cellules latérales de l’hypoderme. Cette contraction semble être régulée par deux voies de signalisation parallèles : la voie let-502/mel-11 et la voie pix-1/pak-1.

Cependant, nous avons observé que contrairement aux cellules ventrales et dorsales, l’actine n’est pas organisée de façon circonférentielle dans les cellules latérales, remettant en question le modèle actuel. Nous montrons également que l’actine s’accumule aussi niveau des membranes basolatérales. Afin de réviser le modèle concernant l’organisation des forces de contraction responsables de la déformation des cellules au cours de l’élongation, nous mesurons la vitesse de déformations des membranes et la dynamique d’assemblage des foci d’actine dans les différents axes des cellule de l’hypoderme. Nous investiguons aussi le rôle des voies de signalisation let-502/mel-11 et pix-1/pak-1 dans ces évènements. Cette étude fournira un modèle morphologique et dynamique permettant de mieux comprendre les évènements régissant l’élongation embryonnaire précoce.