144 - ARN et médecine moléculaire

La recherche sur le cannabis a été étouffée par sa criminalisation historique, laissant aux scientifiques une compréhension limitée des gènes contrôlant son cycle de vie, en particulier ceux affectant l'expression sexuelle du cannabis. Le cannabis est principalement dioïque, avec un génome diploïde (2n =20) contenant une paire de chromosomes sexuels polymorphes : XX pour les femelles et XY pour les mâles. Seules les fleurs femelles produisent une quantité considérable de cannabinoïdes et de terpènes médicalement importants. Au fil des ans, les producteurs ont développé des méthodes de production de graines féminisées (n'ayant que le complément chromosomique XX) en utilisant du thiosulfate d'argent (STS), un puissant antagoniste de l'éthylène ; suggérant que la voie de biosynthèse et de signalisation de l'éthylène joue un rôle crucial dans l'expression sexuelle du cannabis. Donc, nous suggérons que le sexe du cannabis n'est pas seulement contrôlé par les chromosomes sexuels, mais par l'ensemble du génome et les changements au niveau de l'épigénome. Par conséquent, nous essayons d'élucider le rôle de la biosynthèse et de la signalisation de l'éthylène dans le contrôle de l'expression sexuelle à l'aide d'analyses différentielles du transcriptome entier. Nous explorons également l'impact de la féminisation sur le produit final et ces effets possibles.

Les petits ARN nucléolaires (snoRNA) sont des ARN non-codants bien connus pour leur rôle dans la biogénèse des ribosomes. Les deux dernières décennies ont démontré des fonctions régulatoires additionnelles pour les snoRNA mais dont l’étendue est encore inconnue. L’importance des snoRNA est supportée par le fait que leur dérégulation peut causer diverses maladies. Chez les mammifères, la plupart des snoRNA exprimés sont encodés dans les introns de gènes plus longs et requièrent l’expression et la maturation de ces ‘gènes hôtes’ pour leur propre expression. Cependant, alors qu’il est attendu que les snoRNA et leur gène hôte aient une expression corrélée, nos analyses de transcriptomique indiquent des relations plus complexes incluant des paires de snoRNA et gènes hôtes anti-corrélés et l’utilisation de la dégradation des ARNm non-sens (NMD) et de promoteurs doubles pour découpler l’expression des deux types de gènes. Pour caractériser plus extensivement ces relations, nous avons analysé des ensembles d’interactions ARN-ARN à haut-débit, identifiant des dizaines de snoRNA intéragissant avec leur transcrit hôte, avec la capacité de former des structures secondaires alternatives résultant en l’épissage alternatif du transcrit hôte. Alors que les snoRNA avaient toujours été présentés comme des passagers inertes, nos résultats indiquent une relation bidirectionnelle complexe pour certaines paires de snoRNA-gène hôte et un nouveau mécanisme de régulation de l’expression des gènes.

L’épissage des pré-ARN messagers (ARNm) nécessite l’excision de nombreux introns le long du même transcrit. De manière combinatoire, l’ordre d’excision des introns peut emprunter des milliers de voies différentes, chacune d’entre elles exposant un ensemble distinct d’éléments cis-régulateurs qui contribuent à l’épissage alternatif. L’ordre d’épissage des pré-ARNm humains n’a pas encore été élucidé en raison de défis techniques liés à l’analyse quantitative de longues molécules d’ARN. Nous avons donc étudié l’ordre d’épissage post-transcriptionnel dans des cellules humaines à l’aide du séquençage direct d’ARN par nanopores. Nous avons observé que l’ordre d’épissage des pré-ARNm multi-introniques n’est pas stochastique, mais plutôt prédéterminé, c’est-à-dire que la majorité des gènes empruntent seulement quelques ordres d’épissage principaux. Ces ordres d’épissages sont conservés parmi différents types cellulaires et pendant la différentiation de neurones moteurs, ainsi qu’entre isoformes alternatifs du même gène. En outre, le séquençage et l’analyse de cellules provenant de différents individus ont révélé divers exemples d’ordres d’épissage spécifiques à certains allèles, suggérant que la séquence de l’ARN contribue à la détermination de l’ordre d’épissage. En conclusion, nos résultats démontrent que l’ordre d’épissage multi-intronique est prédéterminé chez l’humain et qu’il est partiellement régulé par la séquence d’ARN.

Les acides nucléiques sont des acteurs attractifs dans le développement de biosenseurs par leur faible coût de production, stabilité et sensibilité. Ces biosenseurs peuvent être créés à partir d’acides nucléiques catalytiques : des ribozymes (basés sur l’ARN), ou des DNAzymes (basés sur l’ADN).

Notre groupe a contribué à développer en collaboration plusieurs outils qui génèrent une liste de ribozymes capables de cibler une séquence fournie par l’utilisateur : Ribosoft et TriCleaver. TriCleaver permet de créer plusieurs ribozymes capables de cibler des répétitions pathologiques (triplets GCN) dans l’ARNm PABPN1. Des outils comme CRISPR-Cas9 ne permettent pas de discriminer les transcrits sains, contenant ~10 répétitions, des transcrits pathologiques contenant eux, 12 à 17 répétitions. PABPN1 est impliqué dans la maladie de la dystrophie musculaire oculo-pharyingée (OPMD). Avec nos collaborateurs, nous avons pu prouver l’activité de ribozymes seulement sur les vessions mutantes des ARNm impliqués dans l’OPMD, de même que pour d’autres maladies causées par des répétitions de séquence.

En parallèle, afin d’améliorer l’efficacité de ces ribozymes et notre capacité de prévisions de ces outils, nous souhaitons comprendre comment les interactions pseudo-nœud des tiges I et II du ribozyme Hammerhead modulent son l’activité.

Canid herpesvirus 1(CHV-1) provoque une maladie hémorragique mortelle chez les chiots et des avortements spontanés chez les chiennes  gestantes. Notre hypothèse est que l'infection par le CHV-1 modifie les niveaux de microARN cellulaires pour promouvoir la réplication virale. Des cellules épithéliales canine sont été soit mock-infectées, soit infectées pendant 6 et 12 h. Les petits ARN totaux ont été isolés, soumis à un séquençage d'ARN profond (RNAseq), et les résultats comparés à la miRbase v22.1. Sur un total de 282 microARN canins, seuls 28 présentaient un changement statistiquement significatif de leurs niveaux ≥50 % (p < 0,01) suite à une infection par le CHV-1. Plusieurs de ces microARN ont été exprimés à partir du chromosome X, ce qui est convaincant puisque de nombreux microARN codés sur ce chromosome ont des fonctions immunomodulatrices. Dans des expériences de validation, nous avons étudié les niveaux de microARNprimaire parRT-qPCR, et quantifié les microARN matures par Stem loop RT-qPCR. Nous avons constaté que les niveaux des formes primaires et matures de mir-146a et mir-8908b sont régulés à la hausse à 12 hpi.La fonction de mir-8908b n’est pas connu.Des cibles potentielles de mir-8908b ont été identifiées par bioinformatique et les séquences insérées dans des vecteurs rapporteurs pour validation. Comprendre le rôle des microARN cellulaires dans l’infection par CHV-1 révélera des cibles potentielles pour le développement de nouveaux traitements.

La famille des microARN (miARN) humains let-7 est composéede treize membres qui jouent des rôles essentiels dans plusieurs processus biologiques, tels que le développement cellulaire et la suppression de tumeurs. L’altération des niveaux de miARN let-7 est associée à plusieurs types de cancers. Dicer est l'endoribonucléase responsable de la conversion du précurseur de miARN (pré-miARN) en miARN mature et joue ainsi un rôle crucial dans le contrôle des niveaux cellulaires des miARN let-7. On suppose que les différentes séquences et caractéristiques structurales des précurseurs de miRNA let-7 pourraient être responsables des activités différentielles de liaison et clivage par Dicer. Notamment, contrairement à la plupart des pré-miARN, neuf ARN pré-let-7 contiennent un surplomb de 1 nt en 3' et ces pré-miARN sont mono-uridylés in vivo, vraisemblablement pour permettre un clivage efficace par Dicer. Dans cette étude, nous avons systématiquement analysé comment la séquence et les caractéristiques structurales des treize pré-miARN let-7 humains affectent la liaison et le clivage par Dicer en effectuant des études de liaison et de cinétique in vitro à l'aide d’une protéine Dicer humaine purifiée. Notre étude accroît les connaissances actuelles concernant la promiscuité du substrat de Dicer et fournit de nouvelles informations mécanistiques concernant l'effet des modifications en 3' sur la liaison et le clivage par Dicer.

La formation de métastases du cancer du sein implique une transition cellulaire d’un état épithélial statique vers un état mésenchymateux mobile (TEM). Cette transition est un processus caractérisé par des changements d’expression génique modulés par des facteurs de transcription et de remodelage de la chromatine. Une littérature grandissante démontre que les ARNs noncodants (ARNnc) sont des acteurs clés dans la régulation de processus cellulaires.

Pour identifier les ARNnc régulant la TEM, nous avons utilisé des cellules épithéliales mammaire traitées au TGFb-1 pour induire une TEM. Nous avons procédé à des analyses par ARNseq au cours du temps pour identifier des ARNnc impliqués à différents stades de la TEM. Nous avons aussi procédé à des analyses par ATACseq pour caractériser des régions de la chromatine différentiellement ouvertes, correspondant à de potentielles régions régulatrices du génome lors de la TEM. Nous avons identifié près de 1,300 ARNnc régulés différentiellement au début de la TEM (12h/24h) et qui pourraient être impliqués dans sa progression. Nous procédons à des études de gain/perte de fonction par CRISPR pour caractériser leurs rôles cellulaires. Nous avons aussi identifié de nouveaux ARNnc non-annotés dont nous caractériserons la séquence par séquençage à longue lecture.

L’identification d’ARNnc régulant la TEM permettra une meilleure compréhension du rôle des ARNnc dans la formation des métastases, et génèrera de nouvelles cibles thérapeutiques.

La longueur des télomères est maintenue par une enzyme spécialisée appelée télomérase. Dans les cellules somatiques, l'expression de la télomérase diminue, laissant les télomères de plus en plus courts. Les cellules entrent alors en sénescence, caractéristique du vieillissement. Dans 90% des cancers, la télomérase est réactivée et rallonge les télomères, rendant ainsi les cellules immortelles. L’homéostasie des télomères est modulée par le complexe shelterin qui comprend la protéine POT1 qui lie l’extrémité simple-brin des télomères et contrôle l’activité de la télomérase et de la kinase ATR. Or, des mutations de POT1 ont été répertoriées dans plusieurs cancers, causant une élongation anormale des télomères, selon un mécanisme encore inconnu.
Notre équipe a développé une approche d’imagerie de molécules uniques de l'ARN de la télomérase hTR, qui permet d’observer les particules de hTR et le complexe télomérase par microscopie à fluorescence en temps réel afin de quantifier la colocalisation de la télomérase aux télomères. Nous avons ainsi pu montrer que POT1 contrôle l’accès et la dynamique de la télomérase aux télomères. Nos résultats montrent que certains mutants pro-cancérigènes de POT1 favorisent l’accès de la télomérase aux télomères, mais que cet accès est réduit lorsque ces cellules sont traitées avec un inhibiteur d’ATR. Cette étude permettra de mieux comprendre comment des mutations dans POT1 affectent l’homéostasie des télomères et l’immortalisation cellulaire.

La dysplasie alvéolo-capillaire (ACD/MPV) est une maladie rare et létale caractérisée par une altération grave du développement pulmonaire. Des mutations inactivatrices du gène FOXF1, qui code pour un régulateur transcriptionnel du mésenchyme pulmonaire, sont fréquemment retrouvées chez les patients atteints d'ACD/MPV. Or, dans plusieurs cas où FOXF1 reste intact, des délétions chromosomiques affectant le lncRNA adjacent FENDRR sont trouvées. Nous avons précédemment montré que la délétion de Fendrr chez la souris est létale en raison de défauts du mésenchyme pulmonaire rappelant l’ACD/MPV. Cependant, le mécanisme exact par lequel FENDRR régule la fonction des cellules mésenchymateuses et si celui-ci implique FOXF1 reste inconnu. Ici, nous montrons que la déplétion de FENDRR humain, à l'aide d'oligonucléotides antisens, n'affecte pas l'expression de FOXF1 au niveau de l'ARN ou de la protéine. Inversement, la déplétion de FOXF1 diminue l'expression de FENDRR, indiquant que ce dernier est une cible en aval de FOXF1. Néanmoins, nous avons constaté que FENDRR et FOXF1 sont nécessaires pour limiter la prolifération des fibroblastes pulmonaires embryonnaires. Pour déterminer si les deux régulent des voies convergentes, nous caractérisons le mécanisme d'action de FENDRR en identifiant ses partenaires d’interaction. Ensemble, ces expériences fourniront des informations clés sur le rôle respectif du lncRNA FENDRR et de FOXF1 dans les cellules pulmonaires.

L’encéphalomyélite myalgique (EM) est une maladie complexe présentant des troubles cognitifs associés au malaise après-effort (MAE). Nous avons identifié 11 microARN circulants associés au MAE chez les personnes atteinte d’EM (PAEM). Nous proposons qu’une perturbation de l’expression de certains microARN contribuerait à l’altération des fonctions cognitives chez les PAEM. Notre cohorte est composée de 80 PAEM et de 50 sujets témoins appariés. Tous les participants ont été soumis à une stimulation mécanique induisant le MAE. Des échantillons sanguins ont été prélevés et les fonctions cognitives ont été évaluées avec le test BrainCheck® avant et après l’induction du MAE. L’évaluation des différents domaines cognitifs a permis des stratifier les PAEM en trois clusters grâce à un algorithme développé par une approche d'apprentissage automatique. Les niveaux d’expression des 11 microARN associés à l’EM ont été mesurés par qPCR, mettant en évidence une corrélation entre l’expression différentielle de quatre microARN (miR-29a-3p, miR-150-5p, miR-181b-5p, et miR-486-5p) et la perturbation de certaines fonctions cognitives. Ces quatre microARN sont d’ailleurs connus pour être associés à une variation de la trajectoire cognitive dans différents contextes pathologiques.

CRNDE (Colorectal Neoplasia Differentially Expressed) est un long ARN non-codant surexprimé dans les adénocarcinomes colorectaux. Des niveaux élevés de CRNDE sont fortement corrélés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic, néanmoins sa fonction cellulaire reste incomprise. Nous avons donc étudié l'impact de CRNDE sur les processus cellulaires essentiels à l'acquisition des caractéristiques du cancer grâce à des modèles cellulaires et in vivo de gain et de perte de fonction. Nous avons découvert que la surexpression de CRNDE dans des cellules primaires de souris entraîne une prolifération accrue et une immortalisation cellulaire. À l'inverse, la délétion génétique ou répression de CRNDE dans les lignées cellulaires humaines et murines de cancer colorectal entraîne une diminution de la prolifération cellulaire et une sénescence accrue à la suite de lésions à l'ADN induites par la doxorubicine. Nous montrons également que ces phénotypes sont résolus en trans par la réexpression ectopique des transcrits CRNDE humains ou murins, suggérant une fonction conservée au cours de l'évolution. Enfin, grâce à des expériences de fractionnement cellulaire et de ChIRP-MS, nous avons constaté que CRNDE est lié à la chromatine et qu’il interagit avec des protéines impliquées dans la réponse aux lésions de l'ADN. Nos travaux offrent un nouvel éclairage sur la contribution des ARN non-codants dans le cancer et permettront de déterminer le potentiel de CRNDE comme cible thérapeutique.

Récemment, des ARN modifiés avec des glycanes complexes ont été découverts dans des cellules mammifères. La fonction des glycoARN dans les cellules n’est pas connue, et les stratégies de production et d’analyse de glycoARN restent à être développées. L’ARN exogène est reconnu par plusieurs récepteurs cellulaires. Ces interactions déclenchent une réponse antivirale impliquant l’expression de plusieurs gènes stimulés par l’interféron. Pour établir si la glycosylation synthétique affecte la réponse immunitaire innée contre l’ARN, nous avons testé le polyI:C, un adjuvant connu et une mimique de l’ARN double brin, et un ARN synthétique plus petit qui correspond au YARN5. Ces ARN ont été modifiées avec des glycanes synthétiques (lactose et/ou sialyllactose). Des méthodes d’analyses ont été mise au point pour valider les produits synthétiques. Pour tester l’effet de la glycosylation sur la réponse cellulaire aux ARN, des fibroblastes de prépuce humain en culture ont été traités avec les glycoARN, les ARN non-glycosylés et les produits intermédiaires. L’impact sur l’expression des gènes impliqués dans la réponse immunitaire innée a été quantifié par RT-qPCR. Les résultats ont révélé que les modifications aux ARN entrainent des changements aux niveaux de l’expression de plusieurs gènes de la réponse immunitaire innée. Les approches développées pour ce projet pilote et les résultats obtenus serviront comme point de départ pour investiguer le rôle des glycoARN dans les cellules.

Les riboswitchs sont des éléments de régulation de l’expression des gènes localisés dans la région 5’UTR des ARNm chez les bactéries. Ils sont composés d’un aptamère, pour la fixation d’un ligand spécifique, et d’une plateforme d’expression. La méthode Shifted-Reverse PolyAcylamide Gel Electrophoresis (SR-PAGE) a été développée au laboratoire pour la découverte de nouveaux riboswitchs. Il s’agit d’une approche de migration des ARN, sur un gel de polyacrylamide natif, basée sur leur changement de conformation suite à la fixation d’un ligand spécifique. Cependant, cette méthode est compliquée en terme de manipulations, vu qu’elle se fait en deux étapes de migration et nécessite le démoulage du gel entre les deux étapes pour pulvériser les ligands. De plus, elle ne permet pas de comparer plusieurs ligands potentiels. Nous émettons l’hypothèse que, pour des ligands chargés positivement, il serait possible de simplifier la méthode en vue de tester plusieurs ligands en parallèle. L’objectif de ma maitrise est donc, en premier lieu, la sélection des riboswitchs qui ont un « shift » avec leur ligand spécifique en faisant une SR-PAGE standard. En deuxième lieu, j’utiliserai ces riboswitchs pour mettre au point la SR-PAGE sans démouler le gel de migration, en déposant les ions au niveau des puits pour qu’ils migrent à la rencontre des ARN. Finalement, mon troisième objectif consiste à entamer une approche de criblage à plus haut débit de différents ligands simultanément.

Les miARN de la famille let-7 sont des acteurs importants dans la cellule car ils régulent la différenciation cellulaire, le développement neurologique et la suppression tumorale. La famille let-7 suit la voie canonique de biogenèse des miARN, dans laquelle le miRNA mature est produit suite au traitement de formes immatures par les ribonucléases Drosha et Dicer. Fait intéressant, dans certains types de cancer, les formes précurseurs des miARN let-7 sont présentes, tandis que les formes matures sont régulées à la baisse, ce qui suggère une mauvaise régulation de la maturation des ARN précurseurs de let-7 (pré-let-7) à l'étape de clivage par Dicer. Bien que les ARN pré-let-7 jouent un rôle important dans les cellules, leurs structures n'ont pas été étudiées en profondeur. Ainsi, il n’est pas très clair comment les caractéristiques structurales de ces pré-miARN affectent le clivage par Dicer et la liaison de protéines régulatrices. Nous avons utilisé la méthode SHAPE pour étudier la structure secondaire des ARN pré-let-7. Les résultats indiquent que les précurseurs de miRNA let-7 forment un ensemble dynamique de conformations en solution avec des caractéristiques uniques pour chaque pré-let-7. Cette diversité structurale des précurseurs de la famille let-7 contribue à l’idée que l'enzyme Dicer présente une promiscuité de substrat vis-à-vis ceux-ci.

Le virus herpès simplex 1 (HSV-1) cause typiquement des lésions orales qui se résorbent elles-mêmes et dans de rares cas des encéphalites sévères. Upstream Binding Factor (UBF) active la transcription des gènes ribosomaux par l’ARN polymérase I. Notre laboratoire a découvert qu’UBF a un impact négatif sur la réplication du HSV-1. L’objectif de notre project est d’identifier les acides aminées critiques pour la fonction antivirale d’UBF. Une stratégie de mutagenèse dirigée a été utilisée pour faire des mutations dans la séquence d’UBF. Des domaines fonctionnels spécifiques d’UBF ainsi que des sites de modification post-traductionnelle ont été ciblés. Les substitutions S389A, S412A, S484A, K352A ont été insérées dans l’ADNc de l’isoforme 1 d’UBF. Nous y avons aussi Introduite la mutation «E210K» qui est associée à une maladie neurodégénérative rare. L’expression des formes mutées d’UBF a été confirmé par « Western blot ». L’impact des mutations sur la capacité inhibitrice d’UBF sera testé en infectant des cellules HeLa exprimant les différentes formes d’UBF de manière ectopique. La formation des compartiments de réplication virale de HSV-1 sera suivie par microscopie confocale en observant le marquage pour ICP8, une protéine virale qui lie l’ADN simple brin. Les résultats de ce projet permettront d’identifier les résidus d’UBF critiques pour bloquer la réplication du HSV-1 ce qui permettra une meilleure compréhension du mécanisme impliqué.

L’ARN fraîchement transcrit subit de nombreuses transformations pour devenir un ARNm mature prêt à être traduit. Nous étudions un mode de traitement de l’ARN sans précédent chez le microeucaryote marin Diplonema papillatum, où les gènes mitochondriaux sont fragmentés en morceaux de 40-550 pb appelés modules. Chacun est encodé sur l’un des 81 chromosomes du génome, et est transcrit individuellement. Puis, tous les transcrits de modules d’un gène sont assemblés dans le bon ordre pour former un ARNm contigu mature codant pour une protéine ou un ARNr. Puisque les bouts des modules consistent en 3ʹPO₄ et 5ʹOH (au lieu de 3ʹOH et 5ʹPO₄), nous émettons l’hypothèse qu’une ARN ligase de type RtcB, capable de lier ces types de bouts, catalyse la ligation des modules d’ARN. En effet, trois gènes RTCB sont encodés dans le génome nucléaire de Diplonema. Nous postulons que l’ARN ligase RTCB1 est associée à des facteurs de reconnaissance de l’ARN pour former un complexe ribonucléoprotéique que nous appelons joinosome. Nous tentons d’isoler le joinosome postulé par co-immunoprécipitation en nous servant de RTCB1 de D. papillatum portant une étiquette ProtéineA comme appât et d’en identifier les composantes par spectrométrie de masse. La caractérisation du joinosome promet de conduire à la découverte de nouveaux mécanismes moléculaires, contribuant potentiellement à la boîte à outils moléculaires applicables en biologie synthétique, en génie génétique, et en thérapie génique pour la médecine.

La réplication circulaire de l’ADN (RCA) est une technique isothermale utilisant des sondes d’ADN simple brin, nommées « Padlock probe » (PLP). En 5’ et 3’ de ces PLP, des bras complémentaires s’hybrident à une cible d’acide nucléique, formant une matrice circulaire par ligation. Ces deux bras sont reliés par un espaceur comportant les sites d’amorces d’amplifications. Puisque l’espaceur est librement édité, l’ajout de plusieurs sites d’amplifications permettrait d’attribuer diverses informations à des cibles spécifiques. Il serait ainsi possible d’utiliser de nombreuse PLP (librairies), pour effectuer des tests multiplexés. En vue de tester cette hypothèse, une petite librairie de PLP ayant trois sites d’amplifications a été testée. L’amplification a premièrement été suivie sur un appareil de PCR en temps réel, avec une sensibilité dans les femtomolaires. Elle a ensuite été testée sur deux plateformes de détection présentant un fort potentiel pour des tests au point de service, soit des électrodes d’or et un test colorimétrique. Dans le but de démontrer le pouvoir de multiplexage, un script Python automatisant la création de larges librairies de PLP a permis la conception de trois librairies de taille variable (maximum de 2000 PLP) ciblant des ARN virales. Ce nouveau design de PLP pourrait offrir un grand potentiel d’effectuer des tests multiplexés sur un très large nombre de cibles, notamment les virus dont le génome est hautement variable.