210 - Contributions de la spectrométrie de masse dans les sciences de la santé et de la vie

Le système ubiquitine-protéasome (UPS) contrôle la dégradation, l'activité et/ou la localisation de plusieurs protéines suite à la conjugaison de la petite protéine ubiquitine par l'intermédiaire d'une cascade d'enzymes nommées E1, E2 et E3 (1200 au total). La famille d'enzymes SCF E3 comprend plusieurs récepteurs appelés F-box qui recrutent des substrats d'ubiquitination en impliquant un complexe composé de l'adaptateur Skp1, la cullin CUL1 et la protéine RING domain nommé Rbx1; cette dernière fournissant le site de liaison pour l'enzyme E2 Cdc34A. Plusieurs protéines F-box jouent un rôle essentiel dans le cancer, tels Skp2, Fbw7/hCdc4 et β-TrCP, qui amènent l'élimination de plusieurs régulateurs du cycle cellulaire, protéines suppresseur de tumeur et oncogénique. La molécule CC0651 inhibe l'activité de la E2 Cdc34A. L'analyse cristallographique du complexe Cdc34A et CC0651 a révélé que CC0651 se lie dans une poche cryptique à environ 19 Å de la cystéine catalytique de Cdc34A. Des analyses biophysique, d'RMN et cristallographiques révèlent que l'activité de CC0651 stabilise l'interaction entre Cdc34A et l'ubiquitine. Une série d'analogues de CC0651 appuie la relation entre la stabilisation du complexe ubiquitine-Cdc34A et inhibition enzymatique d'activité d'ubiquitination. La famille complète des 38 enzymes E2 peuvent en principe être assujetti à cette même stratégie d'inhibition qui n'est pas dirigé contre le site actif.

La maladie de Fabry est une maladie lysosomale liée à l'X qui est caractérisée par l'accumulation de glycosphingolipides tels le globotriaosylcéramide (Gb3) et le globotriaosylphingosine (lyso-Gb3) dans les liquides biologiques et au niveau de certains organes. La thérapie enzymatique de remplacement (TER) est possible selon la gravité des symptômes. Les objectifs de cette étude étaient de découvrir de nouveaux biomarqueurs urinaires et plasmatiques liés au lyso-Gb3 qui reflètent la sévérité et la progression de la maladie. Nous avons utilisé une approche métabolomique afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs et de les quantifier par la suite par spectrométrie de masse en tandem. L'urine et les échantillons de sang provenaient de patients Fabry non traités et de témoins sains. Les analyses ont été effectuées avec un spectromètre de masse UPLC-QTOF Synapt. En plus du lyso-Gb3, nous avons identifié sept nouveaux biomarqueurs dans l'urine et le plasma, lesquels sont des analogues du lyso-Gb3 avec des modifications sur les fragments de la sphingosine. Nous avons détecté des concentrations élevées de ces biomarqueurs dans les échantillons d'urine de patients Fabry. De plus, les niveaux d'excrétion urinaire des analogues ont permis d'établir des corrélations avec le sexe et le traitement des patients. Cette étude métabolomique offre pour la première fois une étendue des perspectives analytiques de l'approche UPLC-QTOF pour l'identification de biomarqueurs

Malgré l'existence de nombreux médicaments contre le paludisme, un besoin subsiste pour de nouvelles thérapies réellement efficaces afin d'éradiquer ces maladies. Une fois le cerveau atteint par la maladie, le paludisme tue une personne sur cinq. Une étude récente a démontré que l'ajout de nitroglycérine à un médicament existant rend le traitement beaucoup plus efficace que le médicament seul pour guérir le paludisme cérébral chez la souris. De plus, les parasites du paludisme utilisent de façon quasi-exclusive la glycolyse comme source d'énergie. Or nous avons récemment démontré en laboratoire que la nitroglycérine inhibe l'activité déshydrogénase de l'enzyme glycolytique glycéraldehyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) et sa bioactivation entraine la formation d'oxyde d'azote (NO). Nous examinons à l'aide de la spectrométrie de masse et de simulations numériques l'interaction de la nitroglycérine avec la GAPDH humaine et la GAPDH du Plasmodium Falciparum (paludisme). Postulant que l'inhibition de GAPDH dans ces parasites serait suffisante pour les éliminer, ces travaux de recherche devraient nous permettre d'évaluer le potentiel de GAPDH comme cible thérapeutique contre le paludisme, et pourraient à terme guider le développement de nouvelles thérapies.

La capacité à fournir une mesure pronostique rapide de l'état clinique est importante dans le
cadre des soins intensifs (unités d'urgence et de chirurgie). La rapidité d'intervention et la mise en œuvre d'une stratégie thérapeutique peuvent faire la différence entre la vie et la mort. Aussi, nous avons développé une méthode de micro extraction in vivo sur phase solide (SPME), qui combine la préparation de l'échantillon, un arrêt métabolique et une extraction. Nous avons évalué cette méthode pour surveiller la fonction du greffon à différents stades de la procédure médicale lors de la transplantation d'organes. Pour assurer une meilleure performance analytique, les différents aspects du protocole ont été étudiés et optimisés tels la longueur de la phase stationnaire, le recouvrement de l'analyte, les conditions de transport et d'entreposage, la stabilité des composés extraits et son application en milieu clinique. L'applicabilité de la méthode pour le profil métabolique des organes et pour la surveillance du métabolisme des médicaments a été vérifiée lors de transplantation de poumon et de foie de porcs. Les analyses in vivo SPME de métabolomique permettent l'identification de biomarqueurs pour le dépistage rapide et le suivi par spectrométrie de masse (MS). Différentes stratégies pour le couplage direct de dispositifs de SPME à la MS seront discutés pour l'analyse de tache de sang (EBS)-DART-MS/MS, micro-extraction sur couche mince (TFME) -DART-MS/MS et SPME-ESI-MS/MS.

L'infarctus du myocarde survient lors de l'occlusion de l'une des artères coronaires avec comme conséquence une destruction du muscle cardiaque. Des mécanismes d'autoprotection permettent de limiter ou de réparer certains dommages dans le système vasculaire, impliquant par exemple l'adaptation du phénotype de cellules musculaires lisses. Ces mécanismes de protection peuvent néanmoins conduire à la formation de plaques d'athérome à l'intérieur des vaisseaux et ainsi provoquer un rétrécissement ou le blocage de vaisseaux plus fins. Des études ont montré l'importance des facteurs de risque dans l'apparition et l'aggravation de ces lésions. Un régime faible en carbohydrate et haut en protéine (LCHP) induirait par exemple un nombre plus important de lésions en comparaison d'un régime de type Western. Dans cette étude, l'utilisation de la spectrométrie de masse LC-MS a permis de comparer l'influence des régimesLCHP et Western sur les profils en lipides et en métabolites de souris knockout ApoE-/-. Différentes méthodes d'extraction et techniques de séparation chromatographiques ont été évaluées pour l'analyse d'échantillons de plasma et de tissus. Ces résultats ont permis de mettre en exergue l'influence d'un régime faible en carbohydrate et haut en protéine (LCHP) sur l'augmentation ou la diminution de composés spécifiques.

Une nouvelle stratégie métabolomique a été développée pour l'analyse de métabolites porteurs de fonction amine. Son principe repose sur un étiquettage isotopique des métabolites grâce à une réaction de dérivatisation, et sur l'analyse des dérivés formés parLC-HRMS.Son potentiel a été démontré dans un contexte biologique à l'aide d'un modèle cellulaire (souche HL60) de stress oxidatif.

Deux séries de suspensions cellulaires (n=5)définissaient deux états biologiques différents: une série contrôle (non traitée) et une série mimant un état de stress oxidatif (traitée au peroxyde d'hydrogène). Après extraction, les métabolites porteurs de groupements amine ont été dérivés à l'aide de l'ester benzoique de N-hydroxysuccinimide, soit sous forme légère (cycle benzénique à six ¹²C), soit sous forme lourde (cycle benzénique à six ¹³C). Les échantillons de de chaque série ont été traités respectivement avec le réactif léger ou lourd, mélangés en des rapports 1/1 (v/v) puis analysés parLC-HRMS.

301 paires de métabolites potentiels (i.e., signaux avec même temps de rétention et distants 6 aum)ont ainsi été identifiés. Pour chaque paire, les signaux ont été comparés à l'aide d'un test de t (analyse différentielle). 96 métabolites potentiels différaient significativement (p < 0.01) entre les deux états cellulaires. L'élucidation structurale des composés discriminants a été réalisée en s'appuyant sur la masse exacte, les spectres MS/MS et la comparaison à des standards de référence

La protéine kinase mTOR (mammalian target of rapamycin) favorise la croissance et la prolifération cellulaire en régulant la traduction des ARNm et en augmentant la capacité de la cellule à synthétiser des protéines. Bien que mTOR favorise la traduction de façon globale, son activité semble être particulièrement requise pour la traduction de certaines classes d'ARNm codant pour des protéines impliquées dans la croissance cellulaire.

Afin de mieux comprendre les mécanismes associés à cette régulation spécifique, nous avons caractérisé le complexe protéique s'associant à la coiffe des ARNm à l'aide d'une approche en protéomique quantitative. Ainsi, nous avons identifié plusieurs nouveaux facteurs s'associant avec la coiffe des ARNm de façon dépendante à mTOR, y compris la protéine LARP1 (La-related protein 1). Nos résultats indiquent que LARP1 s'associe avec la machinerie traductionnelle et que sa présence est nécessaire pour la traduction d'une classe d'ARNm contenant un motif oligopyrimidique terminal (TOP). Cette classe d'ARNm code pour plusieurs composants de la machinerie traductionnelle et facteurs d'initiation de la traduction, suggérant que LARP1 joue un rôle important dans la croissance cellulaire en aval de mTOR. Dans l'ensemble, nos travaux révèlent un nouveau mécanisme de régulation de la traduction spécifique des ARNm par mTOR, et impliquent LARP1 comme un joueur important dans la croissance et la prolifération cellulaire.

La température est l'une des variables fondamentales à laquelle les cellules sont exposées. Bien que la réponse cellulaire à des températures élevées a été étudié depuis plusieurs années, les événements de signalisation cellulaire impliqués dans l'adaptation aux changements thermiques restent méconnus. Nous présentons ici les résultats d'une étude phosphoprotéomique a grande échelle portant sur les variations de phosphorylation suite aux changements thermique (chaud et au froid) chez Saccharomyces cerevisiae. Notre approche a permis de mesurer les changements se produisant lors des premières 30 min avec une résolution temporelle de 2 min. Nous avons obtenu les profils dynamiques de phosphorylation pour plus de 4000 sites de phosphorylation, dont 347 sites sont affectées par la température, tels ceux identifiés chez les facteurs de transcription et plusieurs protéines des pores nucléaire. Notre étude a mis en évidence qu'une plus grande proportion des changements dynamiques de phosphorylation sont associés a l'augmentation de température plutôt qu'au froid et que plusieurs sites de phosphorylation ne sont pas affectés de façon réversibles suite aux changements thermiques. Notre étude est la première à avoir développé une approche phosphoprotéomique dynamique pour l'analyse des événements de signalisation associés aux changements thermiques et ces données fourniront de nouvelles pistes biologiques permettant une meilleure compréhension des événements de signalisation thermorégulées.

La voie de signalisation Ras/MAPK régule plusieurs fonctions biologiques, incluant la croissance et la prolifération cellulaire. Cette voie est souvent dérégulée dans le cancer, incluant la plupart des cas de mélanome. RSK (p90 ribosomal S6 kinase) est une protéine kinase activée par la voie Ras/MAPK qui est nécessaire à la croissance des mélanomes, mais relativement peu est connu sur sa fonction exacte et la nature de ses substrats.

Nous avons utilisé une approche en phosphoprotéomique quantitative pour définir les réseaux de signalisation régulés par RSK. Nous avons défini le consensus de phosphorylation régulé par RSK et constaté un chevauchement important avec le consensus de liaison des protéines 14-3-3. Nous avons ainsi caractérisé l'interactome phospho-dépendant de 14-3-3 dans des cellules de mélanome, et constaté qu'une grande proportion de protéines se liant à 14-3-3 sont également des substrats potentiels de RSK. Nos résultats démontrent que la phosphorylation du suppresseur de tumeur PDCD4 sur deux résidus serine par RSK régule sa localisation intracellulaire et son interaction avec 14-3-3. De plus, nos résultats indiquent que la liaison de 14-3-3 à PDCD4 favorise sa dégradation, ce qui suggère un rôle important pour RSK dans l'inactivation de PDCD4 dans le mélanome. Nos travaux suggèrent l'implication de RSK dans une vaste gamme de fonctions biologiques inexplorées, et indiquent que RSK est une cible thérapeutique potentiellement intéressante pour le traitement de mélanome.

L'immunopeptidome du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (iCMH I) regroupe les peptides présentés par les molécules du CMH I et permet dedistinguer les cellules saines des cellules infectées ou cancéreuses. Les peptides de l'iCMH I sont issus de la dégradation des protéines intracellulaires et plusieurs études protéomiques ont identifié des protéines issues de la traduction de cadres de lecture alternatifs suggèrant que la complexité du protéome pourrait être sous-estimée. Nous avons développé une nouvelle méthode couplant MS et séquençage d'ARN de nouvelle génération afin de déterminer l'impact de ce protéome alternatif sur la biogenèse de l'iCMH I.

Nous avons séquencé le transcriptome et l'iCMH I d'une lignée B lymphoblastoïde. Nous avons généré 2 bases de données (BD) utilisées pour identifier les peptides détectés par MS : (1) une BD canonique, traduction in silico de l'ensemble des transcrits connus dans leur cadre de lecture canonique ; (2) une BD non-canonique, traduction in silico de l'ensemble des fragments séquencés dans les 6 cadres de lecture possibles. Ainsi nous avons identifié 3427 peptides du CMH I dont 371 propres à la BD non-canonique. Parmi eux, 346 s'avèrent être des peptides cryptiques i.e. issus de cadres de lecture alternatifs. Notre étude est la première à avoir développé une approche protéogénomique permettant l'identification haut-débit des peptides cryptiques de l'iCMH I qui pourraient servir au développement de vaccins anti-cancer.

Les biomarqueurs représentent des outils indispensables pour le diagnostic et le dépistage des maladies tel le cancer. Le plasma sanguin est une matrice de choix pour l'identification de biomarqueurs car cet echantillon est facilement accessible et contient non seulement des protéines plasmatiques mais aussi des protéines secrétées de tous les organes et des tissus du corps humain. Nous pouvons utiliser le plasma afin de détecter différents biomarqueurs associés à une maladie ou à un état pathologique. Cependant, la découverte de biomarqueurs dans le plasma est très difficile étant donné l'étendue des concentrations de protéines plasmatiques s'étalant sur plus de 10 ordres de grandeur et la présence de protéines abondantes représentant plus de 90 % de l'échantillon total.

Nous avons développé une approche permettant l'identification de biomarqueurs sécrétées dans le sang en purifiant les protéines contenues a l'intérieur de vésicules de tissus. Celles- ci peuvent par la suite etre analysées dans le sang par LC-MS-MS en mode MRM. Cette approche a permis la quantification de 371 protéines plasmatiques de faible et moyenne abondance a partir d'une analyse de 30 min. Une étude comparative sur des échantillons de plasma provenant de patients atteints de cancer pulmonaire bénin et StageIA (n = 143 ) a permis d'identifier un groupe de 13 protéines permettant la différenciation des nodules pulmonaires bénins a ceux de cancers du poumon à stade précoce.

L'insulino-résistance est associée à plusieurs anomalies métaboliques telles que l'hypertriglycéridémie, l'hyperinsulinémie, l'hypertension artérielle et est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète. Des études d'expression génique montrent que certains gènes impliqués dans le métabolisme des lipides sont différentiellement exprimés chez les insulino-résistants par rapport aux des individus insulino-sensibles. Par conséquent, notre objectif est de comparer la performance de différentes techniques protéomiques de quantification telles que: iTRAQ, SWATH et MRM chez des sujets insulino-résistants et insulino-sensibles.

Des biopsies duodénales ont été prélevés chez 14 sujets insulino-résistants et 16 sujets insulino-sensibles (groupe contrôle). Les protéines ont été extraites et digérées par la trypsine. Les peptides ont été marqués par iTRAQ ou non-marqués (SWATH et MRM), et analysés par LC-MS/MS (5600 Triple-TOF). Les résultats obtenus par iTRAQ SWATH et MRM montrent que plusieurs protéines impliquées dans le métabolisme des lipides sont sous-exprimées chez les sujets insulino-résistants (eg MTTP, MGAT2 et ACSL5) comparativement aux sujets insulino-sensibles, alors que d'autres montrent un profil de sur-expression (PACAP, APOC1 et MARCKS). Ces résultats confirment que l'insulino-résistance entraine une dysrégulation des gènes clés du métabolisme des lipides/lipoprotéines et que les techniques de quantification ont généré des résultats similaires et complémentaires.

La leucémie promyélocitaire aiguë (APL) est caractérisée par une accumulation anormale de promyélocytes. La forme prédominante de cette maladie est due à une translocation chromosomique résultant en la fusion des gènes codants pour les protéines promyelocytic leukemia (PML) et retinoic acid receptor α (RARα) lequel donne lieu a un arrêt de la différentiation myélocytaire au stade promyélocyte. Une des stratégies présentement utilisée pour traiter l'APL est l'utilisation du trioxide d'arsenic (ATO), lequel induit l'apoptose des cellules leucémiques via la SUMOylation de la protéine PML. Cette modification permet la maturation des corps nucléaires PML dans lesquels de nombreuses protéines SUMOylées seront recrutées. Cependant, l'identité de toutes ces protéines reste encore à élucider.

Cette étude avise l'identification des protéines SUMOylées en présence d'ATO, et d'identifier lesquelles sont dégradées par le protéasome en utilisant le marquage métabolique (SILAC). Après la récolte des cellules, les protéines SUMOylées sont purifiées sur une resine avec Ni immobilisé)avant d'être digérées à la trypsine. Les peptides SUMOylés sont ensuite enrichis par immunopurification à l'aide d'un anticorps reconnaissant le pentapeptide résiduel puis analysés par LC-MS/MS. Nous avons identifié plus de 60 sites de SUMOylation, dont PML (K65, K160 et K490), TOP1 (K153) BCL11A (K833). Globalement, ce projet nous permet de mieux caractériser les événements de SUMOylation suite au traitement à l'ATO.

La dégradation des protéines et le recyclage des acides aminés est nécessaire pour le maintient de l'activité cellulaire. Le système ubiquitine-protéasome est un des constituants important qui assurent la protéolyse et est composé de plus de 1232 gènes. La découverte d'anomalies moléculaires au niveau de ce système dans les cellules cancéreuses et d'autres maladies (Parkinson, Alzheimer, etc.) ont soulevé un fort intérêt thérapeutique. Plusieurs molécules ciblant diverses protéines de ce système sont présentement en essai clinique, dont la molécule CC0651 qui inhibe l'activité de Cdc34a.

Afin d'approfondir l'étude de l'interaction des enzymes E2 avec l'ubiquitine en présence de l'inhibiteur CC0651, nous avons utilisé une méthode combinant la réticulation des protéines, la spectrométrie de masse (MS) et un récent logiciel permettant l'interprétation des spectres MS/MS. La réticulation des protéines du complexe est effectuée avec le disuccinimidyl suberate (DSS) qui entraîne la liaison des lysines distantes à moins de 30 Å. La réticulation de Cdc34a et de l'ubiquitine a mené à la détection de 8 peptides réticulés tandis que 5 ont été observés avec le CC0651. En présence du CC0651, les événements de réticulations sont concentrés dans la région où se lie cette molécule permettant la stabilisation du complexe tel qu'observé paen RMN. Ces résultats démontrent que la combinaison de la réticulation et la MS permet d'étudier la structure d'un complexe et les effets d'un composé sur celle-ci.