205 - Les progrès de la science en reproduction chez les animaux de production : du fondamental à l’appliqué

Des souris possédant le gène Secreted frizzled-related protein 4 (Sfrp4, un antagoniste de la signalisation WNT) invalidé ont démontré une hypersensibilité aux gonadotrophines, mais le mécanisme par lequel SFRP4 affecte leur signalisation reste à être élucidé. Un prétraitement de cultures primaires de cellules de la granulosa avec du SFRP4 exogène avant le traitement avec la FSH a inhibé l’augmentation des niveaux d'ARNm des gènes cibles de cette dernière (Cyp19a1, Fshr, Lhcgr et Prlr, p<0,05). Pour identifier la voie de signalisation WNT employée par SFRP4, des prétraitements d’inhibiteurs pharmacologiques d’effecteurs respectifs aux principales voies WNT, suivi de SFRP4 exogène, ont révélé que l’action de SFRP4 dépend de GSK3β, effecteur de la voie WNT/CTNNB1. Or, le SFRP4 exogène n’a pas impacté les niveaux de CTNNB1 non-phosphorylée ou totale, suggérant un mécanisme de signalisation non-canonique. En étudiant d’autres effecteurs ciblés par GSK3β, nous avons trouvé que le SFRP4 a augmenté la phosphorylation de l’AMPK, résultant en l’inactivation de l’AKT et de ses cibles FOXO1 (un facteur de transcription agissant en aval de la FSH) et mTOR. La perte d’activité de mTOR a aussi résulté en l’hyperphosphorylation de Beclin1, une protéine pro-autophagique, ainsi qu’une augmentation du ratio LC3BII/LC3BI. Des analyses en cours visent à confirmer le rôle de FOXO1 dans le mécanisme d’action de SFRP4, ainsi qu’à valider nos trouvailles in vitro dans le modèle murin Sfrp4 invalidé.

Nous avons récemment démontré que la délétion conditionnelle de YAP et TAZ dans les gonadotropes hypophysaires de la souris entraîne une augmentation des niveaux basaux circulants de LH (chez les mâles et femelles) et de FSH (uniquement chez les mâles), conduisant notamment à une hyperfertilité chez la femelle.

Afin d'étudier davantage le rôle des effecteurs Hippo auprès des cellules gonadotropes, nous avons croisé des souris portant RS26^YAP5SA soit avec une souche portant le facteur stéroïdogénique-1 (Sf-1)-Cre, soit avec une souche portant un récepteur GnRH-IRES (Gnrhr^GRIC)-Cre. Ces croisements ont généré deux modèles appelés respectivement YAP5SA ; SF1-cre et YAP5SA ; GRIC-cre où l'expression d'une forme constitutivement active de YAP dans les gonadotropes est obtenue après une recombinaison médiée par Cre.

Les analyses hormonales ont indiqué que les taux sériques de FSH et de LH sont significativement compromis chez les souris mutantes mâles et femelles de 6 semaines dans les deux modèles. Les analyses histologiques préliminaires chez ces animaux mutants montrent que, dans les deux modèles, il y a une prolifération de cellules peu différenciées ayant l'aspect d'un blastème. Les hypophyses des mutants YAP5SA ; GRIC-cre semblent également hypertrophiées et présentent des structures folliculaires ou papillaires. Ensemble, ces résultats pourraient nous aider à mieux comprendre les rôles des effecteurs Hippo dans la pathogenèse des troubles hypophysaires des mammifères.

La voie Hippo est une voie de signalisation qui régule la prolifération et la différentiation cellulaire en inhibant l’activité du régulateur transcriptionnel YAP (Yes associated protein). Elle est active dans les cellules de Sertoli, suggérant que l’activité de YAP doit y être finement régulée. Afin d’évaluer l’effet d’une activation anormale de YAP dans les cellules de Sertoli, nous avons généré un modèle de souris qui exprime YAP5SA, une version de YAP constitutivement active, et un gène rapporteur LacZ spécifiquement dans ces cellules (Rosa26^YAP5SA/+;Amh-Cre). Nos analyses suggèrent que chez les animaux de 6 semaines, la recombinaison du transgène se produit seulement dans certains tubules séminifères. L’analyse histopathologique des testicules démontre une perte de polarité des cellules de Sertoli exprimant YAP5SA et leur accumulation au centre des tubules tandis qu’une dilatation et une perte des cellules germinales sont visibles dans les tubules adjacents. De plus, l’injection de colorant dans le rete testis démontre que la perte de polarité des cellules de Sertoli bloque la circulation de fluide dans les tubules. Ces résultats suggèrent que l’obstruction de tubules ralentit le flux et augmente la pression exercée par le fluide tubulaire, entraînant la dilation des tubules adjacents. Des expériences sont en cours pour identifier les cibles transcriptionnelles de YAP dans les cellules de Sertoli.

La voie de signalisation Slit/Robo est un acteur potentiel de la folliculogenèse : les souris haploinsuffisantes pour ROBO1 et ROBO2 sont hyperfertiles. De plus, Slit/Robo est connue comme un inhibiteur de l’activation de la voie AKT, impliquée dans la réponse aux gonadotrophines, l’hormone folliculo-stimulante (FSH) et l’hormone lutéinisante (LH).

Notre objectif était d’étudier l’expression et la régulation des effecteurs de la voie et leur rôle dans la fertilité chez la souris.

Des souris ont été traitées avec de la gonadotrophine chorionique équine (eCG) et de la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) : une augmentation significative de Robo1, Robo2 et Slit2 a été observée 4h post-hCG. Des cellules de la granulosa en culture ont été exposées à des traitements avec du SLIT1 et/ou de la LH exogène. Le traitement avec SLIT1 induisait une inhibition de la phosphorylation activatrice d’AKT induite par la LH ainsi qu’une inhibition de l’augmentation des ARNm de Cyp11a1 et Star induite par la LH. La synthèse de progestérone a également été inhibée par le traitement SLIT1, après 1h, 2h, 4h et 8h de traitement LH. Les souris déficientes pour SLIT1 démontraient une augmentation significative des niveaux d’ARNm de Cyp11a1, Hsd3b2 et Star, 4h et 12h post-hCG par rapport aux souris de type sauvage. Enfin, les souris déficientes pour SLIT1 présentaient une hyperfertilité.

SLIT1 est un inhibiteur de la stéroïdogenèse LH-dépendante, cependant, le mécanisme d’action reste à déterminer.

Les tumeurs des cellules de la granulosa (TCG) sont les néoplasies génitales les plus fréquentes des juments. Le plus souvent, la structure polykystique d’un des ovaires, en est caractéristique et reflète les désordres de prolifération cellulaire. Afin d’aider à comprendre ces phénomènes, nous nous sommes intéressés à la voie Hippo, voie moléculaire jouant un rôle clé dans le contrôle de la prolifération cellulaire. Nous avons supposé que cette voie était perturbée en contexte tumoral. Pour le prouver, nous avons mis en œuvre de l’immunohistochimie, des Western Blot et des expériences de polymérisation en chaine (PCR) sur des échantillons d’ovaires tumoraux et de contrôle, conservés en blocs de paraffine. La présence des protéines YAP et TAZ – effecteurs clés de la voie Hippo – a pu être mise en évidence au sein de tous les tissus testés. Cependant, leur localisation intracellulaire semble différer entre les populations tumorales (présence cytoplasmique seulement) et de contrôle (présence cytoplasmique et nucléaire). Cette répartition suggère une répression de l’action pro-proliférative de YAP et TAZ dans les TCG ; hypothèse appuyée par nos résultats préliminaires de PCR qui montrent une tendance à la répression des gènes cibles (CTGF, ANKRD1 et CYR61) dans les tissus tumoraux. Ces données laissent penser qu’il existe des mécanismes anti-oncotiques agissant via la voie Hippo dans les TCG équines, différant de la sorte des TCG chez la femme (malignes et métastatiques).

La fertilité des vaches laitières a considérablement diminué depuis les années 50. Cela peut s’expliquer en partie par la forte mobilisation du tissu adipeux engendrée par la lactation. En effet, pendant la lactation, l’énergie ingérée est inférieure à l’énergie dépensée et les vaches rentrent en bilan énergétique négatif (BEN). Le tissu adipeux sécrète les adipokines connues pour réguler la fonction du follicule ovarien. Une famille d’adipokine a récemment caractérisé : Fibronectin type III domain-containing (FNDC). Le plus étudié est FNDC5 et son fragment clivé et sécrété appelé irisine. Le récepteur de FNDC5/irisine est un hétérodimère d’intégrine ITGAV/ITGB1. L'effet de FNDC5/irisine sur le fonctionnement de l'ovaire chez les vaches reste à élucider.

L’objectif de cette étude est de déterminer si l'irisine pourrait affecter la fertilité en agissant sur la stéroïdogenèse des cellules de la thèque bovines (bTC).

Nous avons d’abord étudié par RT-qPCR si FNDC5, ITGAV et ITGB1 étaient exprimés dans les bTC. Ensuite, nous avons déterminé l’effet de l’irisine sur la sécrétion de testostérone (ELISA), prolifération (BrdU) et enfin sur le métabolisme du glucose (absorption du glucose et sécrétion de lactate).

Nous avons alors montré que FNDC5, ITGAV et ITGB1 étaient exprimés dans les bTC. L'ajout d'irisine aux bTC en culture n’a pas eu d’effet sur la prolifération cellulaire et la sécrétion de testostérone. En revanche, l'irisine a diminué l’absorption du glucose et la sécrétion.

Le follicule ovarien assure le développement et la maturation des ovocytes. Il est composé entre autres, des cellules de granulosa (CG), lesquelles jouent des rôles essentiels. L'objectif était d'identifier par RNAseq les gènes différentiellement exprimés (GDE) dans les CG de follicules dominants (FD: >8 mm) comparés aux petits follicules antraux (PF: 2-4 mm). Les ARNs totaux des CG ont été isolés afin d'établir les génothèques d'ADNc par la trousse KAPA RNA Hyperprep RiboErase. Les génothèques ont été séquencées en moyenne à 75 millions de reads ("paired-end") par l'appareil Nextseq 500 (Illumina). Les résultats de RNAseq ont été confirmés par des analyses qPCR de gènes sélectionnés. Un total de 670 GDE dans les DF comparés aux PF ont été identifiés (fold-change ≥ 2; P<0,05) dont 645 correspondent à des gènes codants pour des protéines et 25 long ARN non-codants. Les données du séquençage ont été confirmées par RT-qPCR pour l'expression différentielle entre DF vs PF de 44 gènes. L'analyse des GDE par les logiciels Metascape et gProfiler ont permis d'identifier les processus biologiques enrichis (termes Gene Ontology) dans les CG du FD. En conclusion, nous avons identifié des gènes régulés positivement dans les CG qui interviennent dans la croissance finale du FD ou préovulatoire. Certaines voies de signalisation bien connues ont été identifiées, toutefois plusieurs autres représentent des cibles intéressantes pour la recherche dans l'objectif d'améliorer la fertilité bovine.

Un nombre grandissant de données implique l'introduction d'erreurs épigénétiques comme cause de certains syndromes développementaux et d'infertilité. Des mutations des gènes de la famille Heterochromatin Protein 1 (HP1) ont été récemment identifiées dans des désordres neurodéveloppementaux et des pertes de grossesse à répétition. Les HP1s se lient à certaines marques épigénétiques pour compacter le brin d’ADN et supprimer l’expression génique.

Immédiatement après la fécondation, les marques épigénétiques sont effacées, puis rétablies lors du remodelage épigénétique. Notre hypothèse est qu’un dysfonctionnement des HP1s dans l’ovocyte pourrait entraîner des erreurs dans la mise en place de l’épigénome maternel et embryonnaire, impactant le développement fœtal. Le but de notre projet est d’évaluer le rôle des HP1s maternels lors de la transition materno-zygotique.

Pour cela, nous utilisons un modèle murin ayant une délétion conditionnelle des HP1s dans leurs ovocytes pour étudier le développement d’embryons issus ces femelles. Nos résultats préliminaires indiquent que la suppression de HP1 dans les ovocytes résulte en des retards de croissance sévères, des malformations crânio-faciales et des résorptions embryonnaires dans la progéniture de ces femelles.

Ces résultats suggèrent que les protéines HP1s maternelles, présentes dès l’ovocyte, seraient requises dans les stades précoces du développement, avant l’activation du génome embryonnaire.

L'activité ovarienne et des cellules de granulosa (GC) sont contrôlées par différents gènes. Des études antérieures ont suggéré un rôle potentiel des protéines Tribbles pseudokinases (TRIB) 1, 2 et 3 dans la fonction des GC chez la vache. Les protéines TRIB sont impliquées dans divers processus biologiques mais leurs rôles dans les GC restent à être élucidés. Les TRIB joueraient des rôles cruciaux dans la régulation de la fonction et de l'activité des GC et activeraient des voies de signalisation distinctes. Des analyses qPCR utilisant des échantillons in vivo de CG et de cellules de thèque (TC) de follicules dominants à jour 5 du cycle œstral (DF) et de follicules ovulatoires 24h après l'injection d’hCG (OF) ont montré que TRIB1 et TRIB3 sont induits par l’hCG dans les OF par rapport aux DF alors que TRIB2 est supprimé par l’hCG dans les OF. TRIB1 et 3 sont présents dans les GC et les TC alors que TRIB2 est uniquement présent dans les GC. Des analyses Western ont montré que la LH inhibe l’expression de TRIB2 dans les CG en culture alors que TRIB3 serait induite par LH. Par ailleurs, le traitement avec FSH a stimulé l'expression de TRIB2. Ces résultats démontrent une régulation différente des TRIB lors du développement folliculaire et en réponse aux gonadotrophines. Les expériences fonctionnelles fourniront une vue plus large des voies de signalisation régulées par les TRIB dans les GC et leurs gènes cibles affectés lors du développement folliculaire ovarien et l'ovulation. 

La production bovine utilise une combinaison de techniques de reproduction assistée (TRA) afin d’améliorer le gain génétique et le rendement grâce à la réduction de l’intervalle entre les générations. Il a été démontré que ces techniques engendrent des taux plus élevés d’anomalies développementales chez les veaux, impactant négativement le bien-être animal, le profit génétique et les coûts reliés. Plusieurs étapes des TRA coïncident avec des périodes du développement où les marques épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et les marques d’histones sont reprogrammées. Certaines anomalies ont été associées à des défauts épigénétiques ayant une prévalence accrue par l’utilisation des TRA telles que la production in vitro d’embryons. Même avec une série d’analyses morphologiques très strictes et un dépistage génétique permettant d’assurer leur qualité, une faible proportion des embryons produits in vitro peuvent donner naissance à des veaux anormaux.

Notre hypothèse est que les erreurs épigénétiques sont déjà établies dans le blastocyste et pourraient être détectées avant le transfert des embryons. L’objectif du projet est d’identifier des marqueurs d’anomalies périnatales. Nous utilisons différentes techniques de séquençage à haut débit permettant de produire, intersecter et comparer l’épigénome de veaux normaux, anormaux et du blastocyste. Nous pourrons ainsi recenser les régions du génome sensibles aux erreurs épigénétiques qui sont identifiables chez le blastocyste.

La baisse de fertilité chez la vache est une préoccupation majeure pour l'industrie laitière au Canada. Les mécanismes moléculaires associés au déclin de l’efficacité de la reproduction demeurent à être investigués. Ankyrin-repeat and SOCS-Box protein 9 (ASB9) a été identifié comme un des gènes induits par l'hormone lutéinisante (LH) dans le follicule ovulatoire. Cependant, son rôle sur l’activité des cellules de granulosa (CG) et diverses voies de signalisation doit être mieux étudié. L'objectif du projet est d'étudier le mécanisme d'action d’ASB9 dans les CG et déterminer si l'induction d’ASB9 par la LH dans les CG est nécessaire pour la régulation de gènes cibles, dont protease-activated receptor 1 (PAR1), et des voies de signalisation impliquées dans la fonction et l’activité des CG. Des CG en culture ont été traitées avec différentes doses de FSH, LH et Thrombine. Les analyses qPCR ont montré que PAR1 est augmentée en présence de FSH et Thrombine. De plus, l’induction de PAR1 dans les CG in vitro était significativement plus importante avec la combinaison de FSH et Thrombine que les traitements séparés suggérant une action synergétique de FSH et Thrombine. Contrairement à FSH, les résultats ont montré que PAR1 était significativement réduite site au traitement LH même en présence de Thrombine, suggérant une régulation de PAR1 par la LH, possiblement via ASB9.
 

La maturation ovocytaire est un processus important durant lequel le gamète femelle reprend la méiose et se prépare à la fécondation puis au développement embryonnaire. Les cellules du cumulus qui entourent directement l’ovocyte soutiennent de nombreux processus physiologiques. Un syncytium électrophysiologique est formé par l’ovocyte, les cellules du cumulus et les cellules de la granulosa permettant le transfert de molécules telles que les dérivés du pyruvate produits par les mitochondries. Dans cette étude, nous avons étudié l'effet de l'hormone de stimulation folliculaire (FSH) sur la dynamique et la fonction mitochondriale dans les cumulus porcins au cours de la maturation in vitro (IVM) des complexes ovocytes-cumulus (COC). Nous avons décrit la morphologie mitochondriale dans les cellules du cumulus au cours de l'IVM en utilisant le TMRM (Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate) pour marquer les mitochondries actives. Comme nous l’avons déjà décrit, avant la maturation, les mitochondries étaient principalement longues. En présence de FSH, les mitochondries apparaissent très allongées après 2h d'IVM et se fragmentent une fois que les 24h de maturation sont complétées. De plus, la FSH a diminué le taux de respiration mitochondriale basale après 12 min d'IVM en même temps que nous avons mesuré une augmentation du taux de la glycolyse basale. Ces observations étaient consistantes au cours des 12 premières heures d'IVM. 

Au cours des dernières décennies, les complications gestationnelles ont augmenté en association avec l'obésité. Bien qu'il ait été démontré que l'activité physique (AP) pendant la grossesse a des effets bénéfiques sur la santé de la mère et de son fœtus, très peu de femmes font de l’AP tel que recommandé.

Compte tenu de l'impact positif que les professionnels de la santé peuvent avoir sur les changements de mode de vie, le but de cette étude est de documenter l'information donnée par les professionnels de la santé aux femmes enceintes concernant la pratique de l'AP pendant la grossesse.

Un questionnaire a été administré aux femmes enceintes lors de leur première visite prénatale. Le questionnaire a été adapté du PPAQ auquel ont été ajoutées des questions sociodémographiques et sur le dossier obstétrique.

À ce jour, 90 femmes ont été recrutées. Nos résultats préliminaires suggèrent que 60% d’entre elles ne discutent pas d'AP avec leurs professionnels de la santé. Parmi celles qui en ont discuté, 35 % n'ont pas reçu d’informations sur les bénéfices de l’AP et 84 % n'ont reçu aucune recommandation quant à la pratique d'AP.

L'AP n'est pas systématiquement abordée lors de la première visite prénatale et, lorsque les professionnels de la santé en discutent, ils donnent souvent aucune recommandation. Il est nécessaire d'améliorer la pratique clinique concernant les recommandations d'AP afin d'améliorer les issues de la grossesse.

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) désigne un état dans lequel le fœtus est pathologiquement empêché d'atteindre son plein potentiel de croissance. Cette condition est associée à des niveaux élevés de morbidité et de mortalité fœtales. Dans des études précédentes sur des souris pré-éclamptiques transgéniques, l'entraînement à l'exercice (ExT) a permis de prévenir le RCIU. L'objectif principal sera d'évaluer les effets bénéfiques de l'ExT sur la grossesse dans un modèle de souris qui subit une restriction intra-utérine sans prééclampsie. Le deuxième objectif de ce projet sera d'observer l'effet de l'ExT sur le transport du glucose dans le placenta. Nous avons utilisé des souris knock-out hétérozygotes du gène p57kip2, qui régule le développement placentaire normal. Pour observer les effets de l'ExT avant et après la grossesse, les souris ont été placées dans des cages d'exercice 4 semaines avant l'accouplement. Au troisième trimester de grossesse, les souris ont été sacrifiées pour la collecte d'organes. Les p57kip2 sédentaires ont montré une altération placentaire accrue ainsi qu'une taille de portée plus petite. L'ExT a permis de prévenir le RCIU et d'augmenter la taille de la portée par rapport au groupe témoin. L'ExT est une méthode efficace pour réduire la morbidité et la mortalité. Ainsi, la prise en charge du RCIU par l'exercice peut conduire à des bénéfices à long terme pour la santé de la mère et du bébé.

La prééclampsie est un trouble hypertensif gestationnel qui se traduit par l’augmentation de la pression artérielle ainsi qu’une augmentation des protéines dans les urines et/ou des dommages aux organes cibles après 20 semaines de gestation. La prééclampsie est souvent associée à un déséquilibre entre les cytokines pro- et anti- inflammatoires circulantes. Il est possible qu’une dérégulation au niveau du tissu adipeux soit aussi présente. Notre objectif est d’évaluer l’effet de l’exercice physique sur l’expression génique et protéique de marqueurs inflammatoires dans les tissus adipeux. Des souris transgéniques exprimant les gènes humains de la rénine et de l'angiotensinogène (R+A+) ont été utilisées et entrainées de façon volontaire (accès à une roue d’exercice). Nos résultats montrent que les souris R+A+ sédentaires possèdent une masse adipeuse viscérale diminuée comparativement aux souris R-A- et que l’exercice réduit le gain de masse adipeuse pendant la grossesse. Nous observons également une augmentation de l’expression génique de Mest/Peg1, un marqueur de la taille des adipocytes avec la gestation et une diminution de son expression chez les R+A+ ainsi que chez toutes les souris entraînées. Nos données montrent également que l’expression génique du Tumour Necrosis Factor alpha aurait tendance à être diminué dans le gras périgonadal. Au terme de ce projet, il sera possible de connaître l’impact de l’exercice et le rôle du tissu adipeux dans le développement de la malad
 

Les tumeurs mammaires félines sont fréquentes et la plupart (85%) sont des carcinomes hautement métastatiques. Les protocoles chimiothérapeutiques disponibles sont peu nombreux et associés à une toxicité non négligeable. La littérature récente rapporte qu’un dérèglement de la voie Hippo et de ses effecteurs protéiques YAP et TAZ est impliqué dans le développement et la progression tumorale mammaire chez la femme et la chienne. Notre hypothèse est que la voie Hippo est impliquée dans la tumorigenèse mammaire chez la chatte. L’objectif est de déterminer l’expression de YAP et TAZ dans la glande mammaire féline normale, dans des tumeurs mammaires bénignes et malignes de différents grades ainsi que dans des métastases et ensuite, corréler ces résultats avec la progression tumorale. L’expression immunohistochimique cytoplasmique et nucléaire de YAP et TAZ a été gradée selon les systèmes Allred et H-score à l’aide du logiciel Qupath. Nos résultats démontrent que les carcinomes mammaires de grades II en montant, démontrent une augmentation significative de l’expression de TAZ, alors que YAP diminue significativement. Ces résultats proposent que TAZ soit impliqué dans la tumorigenèse mammaire chez le chat, mais que YAP ait peut-être un rôle différent chez cette espèce. Les principaux effecteurs de la voie Hippo pourraient représenter une cible thérapeutique, un indice de malignité ou de pronostic.