107 - Organisation des chromosomes et stabilité du génome

Le locus des gènes ribosomaux (ADNr) est un excellent modèle pour étudier les processus à l’ADN dans la chromatine. Chez la levure il y a ~150 ADNr en tandem et leur activité compte pour plus de 50 % de la transcription totale des cellules en division. Cependant, seule une moitié des ADNr est transcrite et a une chromatine «ouverte», dépourvue de nucléosomes. L’autre moitié n’est pas transcrite et a une chromatine «fermée». Notre recherche vise à comprendre comment les dommages UV sont éliminés par la réparation par excision de nucléotides (NER), dans la chromatine. Une trentaine de protéines connues constituent le complexe NER, mais plus de protéines pourraient être requises pour réparer ces dommages dans la chromatine. Cette étude aidera à définir le protéome lié à la NER dans la chromatine. Nous utilisons des levures modifiées pour permettre l’excision des ADNr individuellement sous forme d’anneaux de chromatine. Après purification des ADNr, les protéines co-purifiées sont analysées par LC-MS/MS. Nous avons déterminé l’influence de la force ionique sur le protéome des ADNr isolés. La purification a été menée à 100, 200 et 400 mM KCl. Les analyses de MS ont montré qu’il y avait un enrichissement dépendant de la force ionique des composants de la chromatine, des facteurs de transcription, et des facteurs de modification post-traductionnelles. Nous sommes maintenant en position d’étudier les variations de ces classes de protéines après irradiation aux UV et pendant la NER.

Nos cellules sont exposées à des stress génotoxiques qui peuvent mener à la création de lésions dans l’ADN. Dans les cellules saines, la plupart de ces dommages sont pris en charge par des voies canoniques de réparation telles que la recombinaison homologue (HR). Cependant, durant l’oncogenèse, certaines voies de réparation moins fidèles sont activées, ce qui augmente l’instabilité génomique et accélère la transformation des cellules cancéreuses. Plusieurs de ces voies alternatives sont médiées par la recombinase RAD52, une protéine qui n’est pas essentielle à la survie des cellules normales. Comme les cellules cancéreuses ont des contextes génétiques très différents des cellules saines (e.g. HR-, ALT, etc), plusieurs d’entre elles deviennent dépendantes de voies alternatives de réparation de l’ADN pour survivre et proliférer. Nos travaux visent donc à mieux caractériser ces voies alternatives qui pourraient devenir des cibles thérapeutiques importantes dans plusieurs types de cancers. Ainsi, des expériences de protéomique nous ont permis d’identifier plusieurs nouveaux partenaires d’interaction de RAD52. De plus, des expériences d’immunofluorescences ont permis de confirmer que plusieurs de ces protéines localisent aux sites de dommage et nous testons actuellement l’importance des candidats dans différentes voies alternatives contrôlées par RAD52. 

Notre ADN est la source de notre information génétique et doit être correctement répliqué afin de transmettre son information. Cependant, de nombreux facteurs endogènes et exogènes peuvent nuire à ce processus de réplication et si ces menaces ne sont pas correctement prises en charge, une instabilité génomique en découlera et pourrait mener à des mutations.

Dans ce projet, nous nous focalisons sur un facteur qui nuit à la stabilité de notre ADN, le stress réplicatif (SR). Le SR comprend tous les phénomènes qui vont engendrer un ralentissement/blocage de la fourche de réplication. Il s’agit d’un facteur récurant dans le développement du cancer dû à un niveau de SR plu élevé dans ce cellules (oncogènes, réplication plus abondante…). Par ailleurs, de nombreux traitements utilisent le SR afin de cibler les cellules cancéreuses. Malheureusement, il n’existe aucun biomarqueur efficace permettant de prédire l’efficacité de tels traitements.

Ici, nous proposons de produire des lignées cellulaires dans lesquelles le niveau de SR est augmenté afin de séquencer l’entièreté de leur génome et définir des profils mutationnels à l’aide d’outil bio-informatique déjà mis en place. Par la suite, l’association de ces différents profils permettra d’attribuer une ou des signature(s) mutationnelle(s) liée(s) au SR. Finalement, cette/ces signature(s) mutationnelle(s), pourront être étudiées comme biomarqueurs en réponse à des traitements ciblant le SR.

Plusieurs études ont démontré que le complexe Tip60-p400 pouvait jouer un rôle dans la relation antagoniste entre H2A.Z et la méthylation de l’ADN. En effet, le complexeTip60-p400 serait associé préférentiellement à des régions contenant H2A.Z et protègerait ainsi ces régions de la méthylation de l’ADN en favorisant la dégradation d’enzymes qui méthylent l’ADN (Dnmt3B). Plusieurs études ont démontré qu’il y aurait une relation mutuellement exclusive entre la méthylation de l’ADN et le variant d’histone H2A.Z. Il pourrait donc y avoir l’existence d’un mécanisme de modification des marques épigénétiques existant entre ces deux modes de régulation. Pour tester notre hypothèse, plusieurs essais d’acétylation in vitro ont permis de vérifier si la modification post-traductionnelle sur Dnmt3B par Tip60-p400 est possible. Des résultats préliminaires ont démontré que l’acétylation de Dnmt3B par Tip60 mènerait à son ubiquitination et à sa dégradation. De plus, afin de mieux comprendre le rôle du complexe Tip60-p400 dans ce mécanisme, des protéines recombinantes ont été obtenues afin d’étudier les segments de Dnmt3B qui sembleraient acétylés. En effet, nous démontrons que cette modification semblait être localisée dans le domaine PWWP de la méthyltransférase. Ceci permettrait de comprendre une partie du mécanisme complexe existant entre la méthylation de l’ADN et H2A.Z.

La chimiothérapie est un des principaux traitements contre le cancer, ce traitement se base sur l’induction de dommages à l’ADN entrainant la mort des cellules cancéreuses tout en préservant le plus possible les cellules saines du patient. Les cellules cancéreuses ont souvent des défauts au niveau des voies de réparation de l’ADN et dépendent des voies alternatives moins efficaces les rendant plus vulnérables à la chimiothérapie. Rad52 est une protéine utilisée dans les voies alternatives de réparation de l’ADN qui sont la plupart mal caractérisées.  Ces voies alternatives sont rarement utilisées par les cellules saines, en revanche, certaines cellules cancéreuses utilisent ces voies pour compenser la perte de l’une des voies principales de réparation de l’ADN. Rad52 devient alors importante pour la prolifération et la survie de ces cellules cancéreuses. Mon projet est un criblage de létalité synthétique CRISPR/Cas9surdes cellules Rad52 KO. Ce criblage a pour but de trouver et de décrire de nouvelles relations de létalités synthétiques avec Rad52.  C’est-à-dire d’identifier des gènes dont l’ablation entraînera la mort ou une baisse importante de la prolifération des cellules Rad52 KO.  Ces nouvelles relations de létalité synthétique pourraient éventuellement permettre le développement de nouveaux traitements pour certains types de cancer.

La structure de la chromatine influence la capacité des cellules à répondre aux stress réplicatifs. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les histones H3 nouvellement synthétisées sont acétylée sur la lysine 56 (H3K56ac) et déposées derrière les fourches de réplication. Deux enzymes de la famille des histones déacétylases de classe III, les sirtuines Hst3 et Hst4, déacétylent ensuite ce résidu après la phase S. Les cellules dépourvues de Hst3 et Hst4 présentent une acétylation constitutive sur H3K56, ce qui provoque une extrême sensibilité au stress réplicatif via des mécanismes méconnus. Ici, nous présentons les résultats d'un crible réalisé à l'échelle du génome visant à identifier des mutations qui nuisent à la croissance cellulaire lors de l'inhibition des sirtuines par le nicotinamide (NAM). L'hétérozygotie de gènes essentiels impliqués dans la l’initiation des origines de réplication cause une sensibilité au NAM. Nos résultats démontrent que Rif1 cause des défauts de croissance en présence de NAM. Cet effet est indépendant des fonctions d'homéostasie des télomères de Rif1, reflétant plutôt la répression dépendante de Rif1 des origines de réplication de l'ADN à l'échelle du génome. De plus, nos résultats suggèrent que H3K56ac pourrait moduler l’activité des origines de réplication. Finalement, nos données soutiennent un modèle dans lequel la répression des origines de réplication s’avère néfaste pour la croissance cellulaire en absence de l’activité des sirtuines

HHV-6B infecte près de 90% de la population mondiale avant l'âge de 3 ans et est l'agent éthologique de la roséole. Comme d'autres herpèsvirus, HHV-6 établit une latence à long terme grâce à l'intégration de son génome dans les télomères des cellules infectées. HHV-6 peut être hérité lorsque son génome est intégré dans le génome des cellules germinales et a été identifié comme un agent prédisposant à l'angine de poitrine et à la prééclampsie chez la femme enceinte. Dans les cellules somatiques, le raccourcissement des télomères des chromosomes porteurs de HHV-6 suggère que l'intégration a un impact sur le vieillissement. Des séquences homologues aux télomères situées dans le génome de HHV-6 contribuent à l’intégration, cependant les mécanismes moléculaires sous-jacents sont inconnus. Ici, nous présentons nos travaux portant sur la capacité du virus à inhiber la signalisation de cassures double brin (CDB) de l’ADN. Nos recherches révèlent que la protéine précoce 1 (IE1B) inhibe la phosphorylation de H2AX et la réparation de CDBs dépendantes de la recombinaison homologue. Nos résultats démontrent que IE1B interagit et empêche le recrutement de NBS1 aux CDBs. Bien que la déplétion de NBS1 n'ait pas impact sur la réplication virale, celle-ci inhibe l'intégration du virus.  Ces résultats révèlent que HHV-6 inhibe non seulement la signalisation des CDBs pour empêcher leur reconnaissance par le système immunitaire inné, mais également pour favoriser l’établissement de la latence.

Au Canada, le taux d’infertilité chez les couples a doublé ces trente dernières années. Un couple sur six est désormais considéré comme infertile dû à un dysfonctionnement ovarien chez la femme pour plus d’un tiers des cas répertoriés. Les modifications génétiques suivant le signal ovulatoire dans les cellules de la granulosa ne sont pas encore bien détaillées. Des études antérieures utilisent les cellules de la granulosa murines immortalisées (GRMO2) pour étudier les mécanismes moléculaires modifiant l’expression génique suivant le signal ovulatoire. Le développement d’un modèle de culture primaire de cellules de granulosa de souris permet de mieux identifier ces processus, en se rapprochant davantage du modèle in vivo. L’induction de l’ovulation, puis de la lutéinisation a été effectuée par l’ajout d’hormone chorionique gonadotrope (hCG) ou d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc). L’expression des gènes cibles à la réponse ovulatoire a été analysée par RT-qPCR. Ce modèle a donc permis d’observer la reprogrammation génique dans les cellules de granulosa suite à la réponse ovulatoire.

Les cellules sont exposées à de nombreuses sources de dommages à l’ADN responsable de l’instabilité génomique. Ces dommages sont pris en charge par différentes voies de réparation faisant intervenir des facteurs essentiels dont la fonction est régulée par des modifications post-traductionnelles (MPT). Parmi ces MPTs, l’ubiquitination des protéines, médiées par des enzymes E3 ligase d’ubiquitine, est essentielle pour l’initiation et la modulation de la réponse. Parmi ces E3 ligase, RFWD3, joue un rôle important dans la réponse au stress réplicatif, dans l’induction de la recombinaison homologue et la réponse aux pontages d’ADN inter-brin. En réponse au stress réplicatif, l’une des étapes essentielles à l’initiation de la réponse est le recouvrement de l’ADN simple brin (ADN-sb) par le complexe trimérique RPA. RPA-ADN-sb constitue une plateforme de recrutement de facteurs essentiels à la réparation. RFWD3 interagit et ubiquitine RPA et potentiellement d’autres facteurs pour promouvoir la réparation de l’ADN. Ce projet, en collaboration avec le Dr Wei Zhang, consiste à identifier des variants d’ubiquitines pouvant contrecarrer l’interaction de RFWD3 avec RPA et ainsi inhiber sa fonction dans la réponse aux dommages. Le principe des traitements anti-cancéreux étant de créer des dommages irréparables pour favoriser l’apoptose des cellules cancéreuse, ces variants d’ubiquitine constituerait un outil biologique potentiel à l’amélioration de ces traitements.

Les protéines non-essentielles aux cellules normales mais requises pour la survie de cellules cancéreuses représentent des cibles thérapeutiques potentielles. Parmi ces cibles thérapeutiques, il existe certains facteurs de transcription capables de stimuler l'activité d'enzymes impliquées dans la réparation de l'ADN, notamment la réparation par excision de bases endommagées. La surexpression de ces facteurs est souvent essentielle à la survie de cellules cancéreuses qui produisent un excès de radicaux libres, lesquels causent des lésions de type oxydatif dans l'ADN.  Grâce à la méthode de BioID, nous avons identifié une interaction/ rapprochement entre BCL11A et NTHL1, une glycosylase qui initie la réparation des pyrimidines oxydées. BCL11A est surexprimée dans divers cancers, en particulier le cancer du sein triple négatif. Nous montrons que BCL11A stimule in vitro l'activité enzymatique de NTHL1 favorisant ainsi la réparation de bases endommagées. In vivo, l'inhibition de l'expression de BCL11A par RNAi cause un délai dans la réparation de l'ADN et une diminution de la résistance des cellules aux radicaux libres. Ce délai de réparation de l’ADN peut être corrigé par l’expression d’un peptide, BCL11A160-520, qui est dépourvu d’activité transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que l'expression élevée de BCL11A permet d'accélérer la réparation des lésions oxydatives et de ce fait, favorise la survie des cellules cancéreuses en dépit de niveaux excessifs de radicaux libres.

Dans les cellules humaines, la lysine 20 de l’histone H4 est non-méthylé (H4K20me0) avant son incorporation dans les nouveaux nucléosomes assemblés derrière les fourches de réplication de l’ADN. Après son incorporation dans la chromatine naissante, l’histone H4 est monométhylée sur K20 par la méthyltransférase KMT5A (Set8). L’absence de Set8 mène à du stress réplicatif, des bris d’ADN double-brin (BDB) et à la sénescence. Cependant, les mécanismes expliquant pourquoi l’absence de Set8 cause du stress réplicatif ne sont pas connus. Nos résultats montrent que l’absence de Set8 conduit à l’accumulation du complexe de réplication RPA sur la chromatine, menant à l’induction de BDB. De plus, nous démontrons que l’activité du complexe protéique MMS22L-TONSL, qui lie H4K20me0 et qui favorise le recrutement de la protéine de réparation de l’ADN Rad51 à la chromatine, est la cause primaire du stress réplicatif en absence de Set8. Finalement, nos données indiquent que Set8 cause une augmentation de l’expression de la protéine p21, et que celle-ci contribue au stress réplicatif et à la sénescence causés par l’absence de Set8. Set8 étant souvent surexprimé dans le cancer, des inhibiteurs de son activité ont été développés, avec comme objectif d’inhiber la croissance des tumeurs. Nos recherches permettront de mieux comprendre l’activité biologique de ces composés, et permettra à terme l’optimisation de l’utilisation d’inhibiteurs de Set8 dans le contexte du traitement du cancer.

FOXK1 est un facteur de transcription ubiquitaire chez l’homme important pour la prolifération et le métabolisme cellulaire et retrouvé dérégulé dans certains cancers. Au niveau moléculaire, FOXK1 recrute sur la chromatine plusieurs complexes enzymatiques tel que le suppresseur de tumeur BAP1 ou le complexe répresseur de la transcription NCoR/SIN3A, mais comment FOXK1 coordonne leurs fonctions n’est pas connu. Nos travaux ont permis de mettre en évidence la modification de FOXK1 par O-GlcNAcylation. Cette modification post-traductionnelle, considérée comme un senseur métabolique, est catalysée par l’enzyme OGT, qui transfert, à partir de l’UDP-GlcNAc, un résidu de N-acétyl-glucosamine sur les serines et thréonines pour réguler l’activité des protéines. Notre analyse de spectrométrie de masse nous a permis d’identifier 7 thréonines modifiées par O-GlcNAcylation sur FOXK1. De façon intéressante, l’absence de O-GlcNAcylation inhibe les propriétés de FOXK1 sur la prolifération cellulaire et, au niveau moléculaire, conduit à une perte d’interaction de FOXK1 avec le complexe NCoR1/Sin3A/HDAC3. Ces données suggèrent un modèle où l’activité transcriptionnelle de FOXK1 est régulée en fonction du niveau métabolique cellulaire par la O-GlcNAcylation à travers la modulation de l’interaction d’enzymes associées à la chromatine.

L’infertilité, définie par l’incapacité d’établir une grossesse après un an de rapports sexuels non protégés, affecte 12-15% des couples en âge de procréer. Environ 40% des cas reliés à l’infertilité féminine ont été attribués à un dysfonctionnement ovarien, mais les mécanismes moléculaires coordonnant le processus de l’ovulation sont encore méconnus. Dans un modèle murin, il a été démontré que le récepteur nucléaire orphelin Liver receptor homolog 1 (LRH-1) est indispensable à tous les stades du cycle ovarien. Les travaux antérieurs des professeurs Murphy et Gévry ont confirmé qu’à la suite du signal hormonal initiant l'ovulation, les cellules de la granulosa subissent un important remodelage chromatinien. Ce remaniement coïncide avec la reprogrammation d’une partie des sites d’action dans le génome (cistrome) de LRH-1. Notre hypothèse est que la modification des sites de liaison à l’ADN de LRH-1 est causée par un changement des cofacteurs partenaires de LRH-1 à la suite du signal ovulatoire. Le but principal de nos recherches est d’explorer les complexes protéiques associés à LRH-1 dans l'établissement d’un patron d'expression génique spécifique à l'ovulation en exploitant les technologies émergentes en protéomique. L'approche « Proximity Dependent Biotin Identification (BioID) » sera utilisée pour étudier l'interactome de LRH-1 après le signal ovulatoire dans les cellules de la granulosa murines immortalisées (GRMO2).

L'organisation structurelle des chromosomes est une propriété fondamentale qui définit l'état fonctionnel des gènes et des génomes. L'ampleur des changements structurels subis par le génome des cellules humaines peut être considérable et s'étendre sur plusieurs ordres de grandeur. Au cœur de ces changements se trouve un groupe unique d'ATPases –les protéines SMC– qui agissent comme les principaux effecteurs de la morphologie des chromosomes dans les cellules. Les protéines Smc5/6 jouent un rôle essentiel dans le maintien de la stabilité du génome, mais leur mode d'action exact n'est pas encore compris. Ici, nous démontrons que le complexe Smc5/6 humain reconnaît des configurations inhabituelles dans l’hélice d’ADN et utilise l'énergie associée à l’hydrolyse de l'ATP pour stimuler leur compaction. De plus, nos analyses structurales révèlent l’existence de plusieurs centres d'interaction qui connectent les sous-unités du complexe Smc5/6 et régulent son activité enzymatique. L’inactivation de l’une de ces régions cause un syndrome de rupture des chromosomes chez l'homme. Collectivement, nos résultats révèlent que le complexe Smc5/6 promeut la stabilité du génome en agissant comme un moteur moléculaire responsable du micro-compactage de l'ADN génomique.

L’ubiquitination est une modification post-traductionnelle qui se traduit par l’ajout d’une ou plusieurs molécule(s) d’ubiquitine (Ub), ce qui permet de réguler la dégradation, les interactions protéines ou encore la localisation de la protéine ciblée. L’ubiquitine est produite à partir de 4 différents gènes qui possèdent tous la même séquence en acide aminé. Nous avons identifié un nouveau gène qui code pour une isoforme de l’ubiquitine qui possède 4 acides aminés différents (Q2K, K33E, Q49K et N60S), que nous avons ainsi nommé Ub^KEKS. Ces quatre mutations sont importantes puisque nous avons démontré que Ub^KEKS, contrairement à l’Ub, n’adresse pas les protéines à la dégradation protéasomale. Ces résultats suggèrent donc un rôle différent pour Ub^KEKS

PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) est une protéine impliquée dans la réplication, mais aussi dans plusieurs mécanismes de réparation de l’ADN. Le choix du mécanisme de réparation utilisé par la cellule va être strictement dépendant du type d’ubiquitination sur PCNA. Nous avons identifié PCNA comme une cible d’Ub^KEKS, et l’utilisation de mutants nous a permis de déterminer les lysines qui sont modifiées par Ub^KEKS. De plus, les lignées cellulaires invalidées pour Ub^KEKS présentent un retard de croissance comparativement aux cellules contrôles. Tous ces résultats nous indiquent qu’Ub^KEKS joue un rôle dans la régulation des mécanismes de réplication de l’ADN par la modification de PCNA.

La stabilité du génome est nécessaire au maintien de l’information génétique afin d’éviter l’accumulation de mutation qui favorise le développement du cancer. Lorsqu’il y instabilité génomique, de l’ADN nucléaire peut être relâché dans le cytoplasme sous forme de micronoyaux, de fragments de chromatines ou d’ADN libre. Cet ADN cytoplasmique active le récepteur immunitaire cGAS qui initie une réponse inflammatoire. Cette réponse permet d’alerter l’hôte de la perte de l’intégrité cellulaire. Cette situation survient chez les cellules sénescentes, cancéreuses et chez les cellules avec un défaut au niveau du maintien de l’intégrité génomique. Mes travaux démontrent que cGAS détecte l’ADN cytoplasmique produit par différents types de dommages, incluant les dommages enzymatiques, génotoxiques et oncogéniques. De plus, l’activation de cGAS chez une cellule avec instabilité génomique influence directement son microenvironnement en activant une réponse immunitaire chez les cellules phagocytaires en contact. Mon laboratoire focus maintenant sur le rôle de l’activation de cGAS chez les cellules cancéreuses et chez les cellules polyploïdes en situation physiologique et pathologique.

Les mécanismes contrôlant la régulation transcriptionnelle sont au cœur de l’étiologie de nombreuses maladies humaines. Plusieurs décennies de recherche ont permis de comprendre en profondeur comment les gènes sont régulés individuellement, mais de nouvelles évidences suggèrent que ces gènes sont interconnectés formant des réseaux dynamiques. Nous avons récemment proposé l'existence d’équilibres biochimiques à l’intérieur d’écosystèmes structurés pour expliquer la co-régulation transcriptionnelle des gènes. Nos résultats montrent que l'architecture chromosomique des domaines d'association topologique (TAD) constitue une unité de régulation coordonnée. En effet, l’activation d’un facteur de transcription entraine une redistribution structurée et cohérente des corégulateurs transcriptionnels à l’intérieur des TADs soulignant un effet régional. En fait, nous suggérons que la position d'un gène dans un environnement chromosomique répondant à un signal externe est un indicateur fort de l'expression différentielle par rapport à la liaison directe du facteur de transcription. Globalement, nos travaux permettent d’établir que la présence d’un gène dans un microenvironnement en changement est un déterminant important de la réponse transcriptionnelle.

Les récepteurs nucléaires sont des facteurs de transcription qui contrôlent un large éventail de processus biologiques et influencent de nombreuses maladies humaines. Par exemple, LRH-1 (ou NR5A2) est un récepteur nucléaire orphelin qui joue un rôle essentiel dans la fonction ovarienne et dans la progression des cancers du sein. LRH-1 semble s'associer à différents sites de liaison de la chromatine dans différents tissus, ce qui conduit à la régulation d'un programme d'expression génique distinct. Par exemple, chez l'adulte, LRH-1 est exprimé dans l'ovaire où il contrôle la biosynthèse des stéroïdes et le processus d'ovulation. Néanmoins, lorsqu'il est exprimé dans certains tissus particuliers, LRH-1 peut favoriser la tumorigénèse comme dans le développement d’un cancer du sein.  Ainsi, avec l’aide d’une approche multi-omique pour étudier les réseaux d’expression génique contrôlés par LRH-1, nous avons pu constater des similitudes marquées entre ses 2 systèmes (physiologique et pathologique) qui nous permettent de mieux comprendre son rôle et possiblement de proposer LRH-1 comme cible dans le traitement de l’infertilité et du cancer du sein.

FOXK1 est un facteur de transcription ubiquitaire chez l’homme important pour la prolifération et le métabolisme cellulaire et retrouvé dérégulé dans certains cancers. Au niveau moléculaire, FOXK1 recrute sur la chromatine plusieurs complexes enzymatiques tel que le suppresseur de tumeur BAP1 ou le complexe répresseur de la transcription NCoR/SIN3A, mais comment FOXK1 coordonne leurs fonctions n’est pas connu. Nos travaux ont permis de mettre en évidence la modification de FOXK1 par O-GlcNAcylation. Cette modification post-traductionnelle, considérée comme un senseur métabolique, est catalysée par l’enzyme OGT, qui transfert, à partir de l’UDP-GlcNAc, un résidu de N-acétyl-glucosamine sur les serines et thréonines pour réguler l’activité des protéines. Notre analyse de spectrométrie de masse nous a permis d’identifier 7 thréonines modifiées par O-GlcNAcylation sur FOXK1. De façon intéressante, l’absence de O-GlcNAcylation inhibe les propriétés de FOXK1 sur la prolifération cellulaire et, au niveau moléculaire, conduit à une perte d’interaction de FOXK1 avec le complexe NCoR1/Sin3A/HDAC3. Ces données suggèrent un modèle où l’activité transcriptionnelle de FOXK1 est régulée en fonction du niveau métabolique cellulaire par la O-GlcNAcylation à travers la modulation de l’interaction d’enzymes associées à la chromatine.

L’infertilité, définie par l’incapacité d’établir une grossesse après un an de rapports sexuels non protégés, affecte 12-15% des couples en âge de procréer. Environ 40% des cas reliés à l’infertilité féminine ont été attribués à un dysfonctionnement ovarien, mais les mécanismes moléculaires coordonnant le processus de l’ovulation sont encore méconnus. Dans un modèle murin, il a été démontré que le récepteur nucléaire orphelin Liver receptor homolog 1 (LRH-1) est indispensable à tous les stades du cycle ovarien. Les travaux antérieurs des professeurs Murphy et Gévry ont confirmé qu’à la suite du signal hormonal initiant l'ovulation, les cellules de la granulosa subissent un important remodelage chromatinien. Ce remaniement coïncide avec la reprogrammation d’une partie des sites d’action dans le génome (cistrome) de LRH-1. Notre hypothèse est que la modification des sites de liaison à l’ADN de LRH-1 est causée par un changement des cofacteurs partenaires de LRH-1 à la suite du signal ovulatoire. Le but principal de nos recherches est d’explorer les complexes protéiques associés à LRH-1 dans l'établissement d’un patron d'expression génique spécifique à l'ovulation en exploitant les technologies émergentes en protéomique. L'approche « Proximity Dependent Biotin Identification (BioID) » sera utilisée pour étudier l'interactome de LRH-1 après le signal ovulatoire dans les cellules de la granulosa murines immortalisées (GRMO2).

Les rayons UV produisent des dimères de pyrimidines dans l’ADN et sont une cause majeure de cancers de la peau. La Réparation par Excision de Nucléotide (NER) est le seul mécanisme pouvant éliminer ces lésions dans les cellules humaines. Nous avons développé une méthode de cytométrie en flux permettant de mesurer l’excision des dommages UV et nous avons observé que plusieurs lignées de mélanomes humains sont déficientes pour la NER exclusivement durant la phase S. Cependant, les bases génétiques de ce défaut demeurent inconnues. Afin de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans la NER nous avons produit une librairie de CRISPR/Cas9 dans des fibroblastes humains, puis isolé les mutants déficients pour la NER avec notre méthode de cytométrie. Nous avons identifié 5 nouveaux gènes affectant l’efficacité de NER spécifiquement en phase S, dont Dyrk1A qui est une kinase impliquée dans la prolifération cellulaire. Nos résultats montrent que le défaut de NER lors de la déplétion de Dyrk1A est dû à une augmentation des niveaux de cycline D1, qui est un oncogène fréquemment surexprimé dans plusieurs types de cancers, dont les mélanômes. Nous montrons que des niveaux de cyclin D1 élevés sont responsables du défaut de NER en phase S observé dans certaines lignées de mélanômes. Nos données suggèrent que cycline D1 empêche PCNA de participer efficacement à la NER durant la phase S. Cela représente un nouveau mécanisme par lequel cycline D1 pourrait promouvoir la formation de mélanômes

Le syndrome de Meier-Gorlin (SMG) est une forme de nanisme primordial caractérisé par une taille réduite et un sous-développement des oreilles et de la rotule. Le SMG a déjà été lié à certaines mutations dans des gènes impliqués dans la réplication et la réparation de l’ADN. Un groupe de patients ayant des symptômes correspondant à ceux décrit pour le SMG mais n’ayant pas de mutations dans les gènes déjà associés au SMG a été découvert. Un séquençage de leur génome a permis d’identifier une mutation dans un gène encodant la protéine de réplication GINS3. Pour évaluer s’il existe un lien de cause à effet liant cette mutation au SMG, nous avons utilisé la levure Saccharomyces cerevisiae, des souris et des lignées de cellules humaines comme systèmes modèles. Dans la levure, nous observons que les mutations GINS3 sont associés à des effets négatifs sur la croissance des cellules, la vitesse de la réplication de l’ADN et la stabilité de la protéine GINS3. Dans les souris, l’homozygotie pour un gène GINS3 muté induit la senescence et la létalité embryonnaire. Dans les cellules humaines exprimant GINS3 muté, nous observons un ralentissement des fourches de réplication d’ADN. Nos résultats suggèrent donc un modèle où les mutations GINS3 nuisent à la stabilité de la protéine GINS3, ce qui ralenti la réplication de l’ADN et la croissance cellulaire, et indiquent que GINS3 devrait être ajouté à la liste de gènes associés au SGM.

Les pesticides sont largement utilisés de nos jours et plusieurs de ces produits sont suspectés pour avoir des effets néfastes sur la santé. Une des réponses des cellules face à certains pesticides est l’activation de la voie du récepteur de la dioxine (AhR) qui a pour but de détoxifier celles-ci. Afin d’avoir une meilleure compréhension des effets des pesticides sur les mécanismes cellulaires, un séquençage à haut débit (mRNA-Seq) a été réalisée. Des cellules issues d’un cancer de la glande mammaire (MCF-7) ont été traitées avec trois différents pesticides soit le carbaryl, le linuron et le thiabendazole. Parmi les gènes significativement surexprimés, 12 semblent être affectés par les trois traitements. Sachant que AhR est activé en réponse aux pesticides, nous avons identifié le rôle de AhR dans l’expression des 12 gènes communs en effectuant un siRNA de AhR. Parmi ces 12 gènes on retrouve HMOX1, une hème oxygénase qui a un rôle potentiel dans le cancer. Sa signalisation a été étudiée en réponse aux pesticides par siRNA de AhR et NRF2, un régulateur connu de HMOX1. En conclusion, AhR est important pour l’expression de certains des 12 gènes communs. AhR et NRF2 sont importants pour l’expression de HMOX1. Les pesticides engendrent une réponse cellulaire causant un stress dû à l’activation de AhR et de HMOX1. Cette étude permet une meilleure compréhension de la réponse cellulaire face aux pesticides.

Le suppresseur de tumeurs BAP1 est une déubiquitinase (DUB) qui régule les processus associés à la chromatine et est fréquemment muté dans diverses tumeurs malignes. BAP1 assemble des complexes DUB avec les régulateurs épigénétiques ASXL-1 et ASXL-2, de manière mutuellement exclusive. Ces cofacteurs sont nécessaires pour assurer la stabilité de BAP1 et stimuler son activité DUB. Cependant, la manière dont l'activité DUB de BAP1 est régulée reste largement inconnue. Récemment, l’équipe du Dr Affar a démontré que BAP1 favorise la monoubiquitination des ASXLs. Cette monoubiquitination permet ainsi de réguler leur stabilité, stimuler l'activité DUB de BAP1 et est requise pour la prolifération des cellules de mammifères. De plus, la monoubiquitination des ASXLs est catalysée par la famille UBE2E des enzymes de conjugaison de l'ubiquitine. Cependant, de nouveaux résultats issus de notre laboratoire semblent suggérer qu’un autre mécanisme de coordination du complexe ASXLs/BAP1 serait à l’œuvre. D’après nos études préliminaires, BAP1 serait monoubiquitiné au niveau de son domaine catalytique sur la lysine 127 (K127) d’une manière exclusive à l’ubiquitination des protéines ASXLs, assurant probablement une régulation hautement coordonnée de ce complexe épigénétique. Ainsi, notre hypothèse est que la monoubiquitination de BAP1 pourrait coordonner l'expression de certains gènes impliqués dans la prolifération cellulaire, l'intégrité du génome ainsi que la suppression des tumeurs.

Les mégacaryocytes sont des cellules issues de l’hématopoïèse qui génèrent les plaquettes sanguines par fragmentation de leur cytoplasme. On les retrouve majoritairement dans la moelle osseuse. In vitro, les mégacaryocytes immatures se différencient sous l’effet d’un traitement à la thrombopoïétine pour atteindre un stade de différentiation final ressemblant à la sénescence. Durant ce processus de différentiation, les mégacaryocytes subissent l’endomitose ou les cellules dupliquent répétitivement leur ADN jusqu’à 64 N. Dans plusieurs contextes pathologiques comme le cancer, la réplication soutenue de l’ADN s’accompagne souvent d’instabilité génomique. Afin de déterminer si les mégacaryocytes maintiennent leur intégrité nucléaire durant l’endomitose, nous avons visualiser différents marqueurs comme la protéine lamin A/C et le phospho-γH2AX. Nos résultats obtenus par microscopie confocale démontrent que durant l’endomitose, les mégacaryocytes perdent leur intégrité nucléaire et relâchent des fragments d’ADN. Cette perte d’intégrité s’accompagne de la production de molécules qui font partie intégrante du phénotype de senescence comme l’interleukine-6. Nos résultats soulèvent plusieurs questions sur le rôle de cette perte d’intégrité nucléaire et son implication dans diverses pathologies notamment les leucémies myéloïdes.

La résistance au cisplatine (R-CisP) caractérise les cellules souches (CS) du cancer de l'ovaire (CaOv). Il est donc primordial de surmonter cette R-CisP afin d'améliorer le traitement du CaOv. Nous avions précédemment montré qu'une plus grande disponibilité en RPA est un déterminant majeur de la R-CisP dans le CaOv. Cela suggère que l’augmentation de la disponibilité en RPA serait une caractéristique des CS-CaOv. De plus, les gènes qui contrôlent la disponibilité en RPA pourraient être des cibles thérapeutiques idéales permettant de tuer les CS-CaOv.

On a donc évolué des cellules R-CisP à partir de lignées sensibles au CisP (S-CisP) et, par cytométrie en flux couplée à l’immunofluorescence, on a remarqué l’enrichissement des CS-CaOv dans les lignées R-CisP. Pour retracer l’origine de ces CS-CaOv et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, nous avons analysé le transcriptome des lignées R/S-CisP par RNAseq. Les résultats ont révélé des sous-populations parmi les cellules S-CisP qui ressemble, au niveau de leur expression génique, aux cellules R-CisP. Nous envisageons maintenant, et allons tester, l’idée que ces cellules soient préalablement R-CisP et augmentent leur disponibilité en RPA en réponse au CisP et que la dérégulation des gènes qu’on a identifiés permettra de surmonter la R-CisP.

L’augmentation de la disponibilité en RPA dans les CS-CaOv pourrait donc être la clé pour comprendre et mieux traiter les rechutes chez les patientes atteintes du cancer de l’ovaire.

Nos cellules mènent un combat perpétuel contre divers dommages à l’ADN, endogènes ou exogènes, étant source d’instabilité génétique. Les cellules mettent en place une défense des plus robustes, impliquant un réseau protéique finement régulé. Afin de permettre une coordination spatio-temporelle des divers facteurs protéiques impliqués dans la réponse à ces dommages il existe des modifications post traductionnelles (PTM) incluant la phosphorylation, l’acétylation et ubiquitination. L’ubiquitination est la résultante d’une modification chimique réversible consistant en l’ajout d’une ou plusieurs ubiquitines sur un ou plusieurs résidus lysines d’une protéine cible. Cette PTM est sous l’hégémonie de <600 protéines appelées E3 ligase, mais seulement une faible proportion a un rôle connu dans la réponse aux dommages à l’ADN (DDR). Nos analyses bio-informatiques suggèrent que 180 auraient une localisation nucléaire. Il est donc légitime de se demander s’il n’existerait pas d’autres E3 ligases dans la signalétique de la DDR. Afin d’identifier des protéines d’intérêts dans ce rôle, un criblage a été effectué parmi les E3 ligase nucléaires capables de se relocaliser à la chromatine à la suite de dommages générés par une micro-irradiation laser. Deux candidates, qui n’ont jamais révélé de fonction dans la DDR, ont été retenues comme potentielles gardiennes de l’intégrité du génome. Nos travaux auront pour but de lever les mystères concernant l’implication de ces protéines dans la DDR.

Le complexe TIP60 joue un rôle essentiel dans l’expression et la maintenance du génome, notamment via l’acétylation des histones H4 et H2A par sa sous-unité catalytique KAT5.

Bien qu’il ait été montré que le chromodomaine de KAT5 soit essential chez la levure et lié à la réparation de l’ADN chez l’humain, la fonction précise de ce domaine ainsi que ses propriétés de liaison à la chromatine restent à éclaircir. Des études suggèrent que le chromodomaine de KAT5 se lierait à la marque H3K9me3 dans l’hétérochromatine pour activer ATM en réponse aux dommages à l’ADN. Nos essais à grande échelle de liaison à des peptides et à des nucléosomes indiquent que le chromodomaine de KAT5 ne se lie à aucune marque chromatinienne spécifique. Des expériences in vitro utilisant des complexes TIP60 mutants purifiés, ainsi que nos résultats de ChIP-qPCR, ont démontré que le chromodomaine de KAT5 est essentiel pour l’acétylation des histones, indépendamment des marques d’histones présentes sur le substrat. Nous avons également montré qu’une mutation dans le chromodomaine de KAT5 qui affecte son activité catalytique est impliquée dans un syndrome neurodéveloppemental rare. En parallèle, nos données suggèrent que KAT5 n’est pas requis pour l’activation d’ATM en réponse aux dommages à l’ADN.

Dans l’ensemble nos travaux fournissent une meilleure compréhension du fonctionnement de TIP60 dans la régulation de l’organisation chromatinienne et de comment ses perturbations peuvent mener à des pathologies.

La réponse cellulaire aux cassures d’ADN double brin (CDBs) est orchestrée par l’ubiquitylation de la chromatine qui les entoure. Lors de cette cascade, la E3-ligase RNF168 ubiquityle les lysines 13/15 de l’histone H2A, des modifications qui sont directement reconnues par 53BP1 et RNF169, des facteurs médiant le choix de la voie de réparation en fonction du cycle cellulaire. Récemment, il a été démontré que les niveaux de variants d’histone dans la chromatine entourant la cassure influencent aussi ce choix en favorisant le recrutement de facteurs de réparation par recombinaison homologue ou non-homologue. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces régulations sont toutefois inconnus. Pour déterminer comment les variants d’histone affectent la signalisation de CDBs qui a lieu sur la chromatine, ce projet vise à définir leur impact sur les étapes médiées par l’ubiquitylation de la chromatine dépendante de RNF168. Grâce à un système de reconstitution de nucléosomes à partir d’histones recombinantes, nous avons investigué l’impact des variants d’histone H2A (H2A.X, H2A.Z.1 et 2, macroH2A et H2A.Bbd) et de H3 (H3.3 et CENPA) sur la cinétique d’ubiquitylation de H2A par RNF168. Ensuite, des analyses de type pulldown ont permis de définir comment ils impactent la reconnaissance de H2Aub par les facteurs de réparation 53BP1, RNF169 et RAD18. Dans l’ensemble, cette étude nous permettra de définir le rôle de la composition de la chromatine sur la signalisation dépendante de RNF168

Les dommages UV sont réparés par les 2 sous-voies de la NER : la réparation globale du génome (GGR), qui répare la majorité du génome, et la réparation couplée à la transcription (TCR), qui répare le brin transcrit des gènes. Nous étudions la NER à travers les multiples gènes de l’ARN ribosomal (ADNr). Seule une portion de ces gènes est transcrite par l’ARN polymérase-I (ARNPI), et dépourvue de nucléosomes, là où les ADNr non-transcrits sont recouverts de nucléosomes.

Nous souhaitons comprendre les interactions entre les dommages UV, la NER et la chromatine. Précédemment, nous avons démontré qu’à la rencontre d’un dommage, l’ARNPI est dissociée du brin d’ADN pour être remplacée par des nucléosomes. Nous souhaitons maintenant savoir comment le brin transcrit des ADNr est réparé.

Nous avons utilisé une technique basée sur l’extension d’amorce pour mesurer la réparation de l’ADN à l’échelle nucléotidique.

En accord avec nos connaissances actuelles, le brin non-transcrit est réparé par la GGR. Nous avons trouvé que le brin transcrit est quant à lui réparé non pas uniquement par la TCR, mais également par la GGR. Cette découverte indique que le chargement des nucléosomes susmentionné implique le recrutement d’une sous-voie différente de la NER au lieu de ne représenter qu’un obstacle passif.

Nous souhaitons à l’avenir comprendre plus spécifiquement l’implication des nucléosomes et de l’état de la chromatine après irradiation UV dans la maintenance de la stabilité génomique.

Des facteurs de stress endogènes et exogènes menacent continuellement l'intégrité du génome. Les cassures double brin de l'ADN sont particulièrement dangereuses et favorisent l'instabilité du génome, une caractéristique inhérente au cancer. Face à cela, la cellule déclenche la réponse aux dommages à l'ADN (DDR), qui comprend un réseau de protéines qui fonctionnent collectivement pour détecter, signaler et réparer la lésion. La DDR déploie un mécanisme majeur de remodelage du protéome à travers différentes modifications post-traductionnelles, dont l’ubiquitination. L'ubiquitination est médiée par plus de 600 E3 ligases, dont 330 de type RING ciblant un ensemble spécifique de substrats. 101 de ces E3 Ligase RING auraient une localisation nucléaire, mais seule une poignée a un rôle démontré dans la DDR. Pour identifier de nouveaux facteurs de la DDR, nous avons criblé des E3 nucléaires de type RING humaines marquées par des épitopes pour la localisation sur la chromatine endommagée par une micro-irradiation laser 405 nm. Ce criblage nous a permis d’identifier 7 nouvelles protéines qui se localisent sur la chromatine endommagée de manière dépendante à PARP1. Nous présentons ici un de ces candidats en tant que gardien potentiel du génome humain. Nos travaux identifieront de nouveaux facteurs importants pour la réparation de l'ADN et mèneront à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui préservent la stabilité du génome.

Les variants d'histones jouent un rôle prépondérant dans le contrôle des modifications post-traductionnelles de la chromatine et ainsi sont intimement reliés à plusieurs fonctions biologiques. Nos études précédentes ont identifié une enzyme qui méthyle sélectivement le variant histone H3.1 ; l’histone H3 canonique déposée lors de la réplication. La structure cristalline du domaine SET de « ARABIDOPSIS TRITHORAX-RELATED PROTEIN 5 (ATXR5) », une mono-méthyltransferase spécifique à la lysine 27 de l’histone H3.1, en complexe avec un peptide H3.1 a montré qu’ATXR5 contient un domaine catalytique bi-fonctionnel qui reconnait spécifiquement l'alanine-31 de l’histone H3.1. La variation en position 31 entre l’histone H3.1 et l’histone H3.3, un variant dont l’incorporation à la chromatine est indépendante de la réplication, est conservée chez les plantes et les animaux, et la thréonine-31 dans l’histone H3.3 est responsable de l'inhibition de l'activité d'ATXR5 et de son paralogue, ATXR6. Au cours de la conférence, je partagerai nos plus récentes découvertes concernant la caractérisation structurelle et fonctionnelle d'une protéine capable de se lier spécifiquement à l'histone H3.1. Collectivement, nos résultats suggèrent un modèle simple pour l'hérédité mitotique de la marque hétérochromatique H3K27me1 et un mécanisme assurant la fidélité du dépôt de l’histone H3.1 lors de la réplication de l'ADN.

L’homéostasie cellulaire requiert un contrôle constant de la structure et de l’utilisation du génome. Plusieurs modifications post-traductionnelle, notamment l’acétylation des lysines (Kac), participe à cette régulation activement. En plus de leurs impacts sur l’état général de la chromatine, les histones acétylés agissent comme point d’encrage pour les protéines adaptatrices contenant des bromodomaines (BRDs). Les BRDs sont le principal domaine lecteur d’Kac chez l’humain et, dut à la présence d’une large cavité hydrophobique dans les BRDs, une cible idéale pour le développement d’inhibiteurs chimiques. Pour contribuer aux déploiements des inhibiteurs de BRDs en clinique, nous avons complété une étude systématique des 42 protéines humaines contenant un ou plusieurs BRD. Nos résultats démontrent que ces protéines établissent de larges réseaux d’interactions protéine-protéine associés à la chromatine et que l’inhibition de leurs BRDs remodèle ces réseaux drastiquement. Notre présentation décrira nos efforts pour bonifier notre compréhension des protéines humaines contenant des BRDs, des conséquences moléculaires associés à leurs inhibitions et de leurs fonctions dans la régulation et l’organisation de la chromatine.

La protéine chaperone d’histone FACT, composée de Spt16 et Pob3, occupe les régions transcrites du génome de Saccharomyces cerevisiae où elle joue un rôle important dans le maintien de l’intégrité de la chromatine. Les mécanismes par lesquels FACT est recruté sur les régions transcrites demeurent quant à eux incertains. Les mécanismes proposés incluent i) l’encrage sur l’ARN polymérase II, ii) l’interaction avec divers facteurs d’élongation de la transcription, iii) la reconnaissance de modifications post-traductionnelles sur les histones et iv) la liaison à des nucléosomes partiellement désassemblés. Dans le cadre de la présente étude, nous avons systématiquement testé ces différents mécanismes et concluons que FACT reconnait la chromatine transcrite et non pas l’ARN polymérase II. Nos travaux démontrent que FACT reconnait plus spécifiquement le nucléosome +1 alors que ce dernier est partiellement désorganisé par l’engagement de l’ARN polymérase II. Par la suite, FACT s’étale aux nucléosomes plus en aval avec l’aide du remodeleur de chromatine Chd1. Finalement, nos travaux démontrent également que la protéine à domaine HMG Nhp6 n’est pas impliquée dans la fonction de FACT in vivo.

Le complexe TIP60 joue un rôle essentiel dans l’expression et la maintenance du génome, notamment via l’acétylation des histones H4 et H2A par sa sous-unité catalytique KAT5.

Bien qu’il ait été montré que le chromodomaine de KAT5 soit essential chez la levure et lié à la réparation de l’ADN chez l’humain, la fonction précise de ce domaine ainsi que ses propriétés de liaison à la chromatine restent à éclaircir. Des études suggèrent que le chromodomaine de KAT5 se lierait à la marque H3K9me3 dans l’hétérochromatine pour activer ATM en réponse aux dommages à l’ADN. Nos essais à grande échelle de liaison à des peptides et à des nucléosomes indiquent que le chromodomaine de KAT5 ne se lie à aucune marque chromatinienne spécifique. Des expériences in vitro utilisant des complexes TIP60 mutants purifiés, ainsi que nos résultats de ChIP-qPCR, ont démontré que le chromodomaine de KAT5 est essentiel pour l’acétylation des histones, indépendamment des marques d’histones présentes sur le substrat. Nous avons également montré qu’une mutation dans le chromodomaine de KAT5 qui affecte son activité catalytique est impliquée dans un syndrome neurodéveloppemental rare. En parallèle, nos données suggèrent que KAT5 n’est pas requis pour l’activation d’ATM en réponse aux dommages à l’ADN.

Dans l’ensemble nos travaux fournissent une meilleure compréhension du fonctionnement de TIP60 dans la régulation de l’organisation chromatinienne et de comment ses perturbations peuvent mener à des pathologies.

La réponse cellulaire aux cassures d’ADN double brin (CDBs) est orchestrée par l’ubiquitylation de la chromatine qui les entoure. Lors de cette cascade, la E3-ligase RNF168 ubiquityle les lysines 13/15 de l’histone H2A, des modifications qui sont directement reconnues par 53BP1 et RNF169, des facteurs médiant le choix de la voie de réparation en fonction du cycle cellulaire. Récemment, il a été démontré que les niveaux de variants d’histone dans la chromatine entourant la cassure influencent aussi ce choix en favorisant le recrutement de facteurs de réparation par recombinaison homologue ou non-homologue. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces régulations sont toutefois inconnus. Pour déterminer comment les variants d’histone affectent la signalisation de CDBs qui a lieu sur la chromatine, ce projet vise à définir leur impact sur les étapes médiées par l’ubiquitylation de la chromatine dépendante de RNF168. Grâce à un système de reconstitution de nucléosomes à partir d’histones recombinantes, nous avons investigué l’impact des variants d’histone H2A (H2A.X, H2A.Z.1 et 2, macroH2A et H2A.Bbd) et de H3 (H3.3 et CENPA) sur la cinétique d’ubiquitylation de H2A par RNF168. Ensuite, des analyses de type pulldown ont permis de définir comment ils impactent la reconnaissance de H2Aub par les facteurs de réparation 53BP1, RNF169 et RAD18. Dans l’ensemble, cette étude nous permettra de définir le rôle de la composition de la chromatine sur la signalisation dépendante de RNF168

Lymphocyte development from hematopoietic stem cells (HSCs) is accompanied by a loss of self-renewal capacity and a progressive restriction of developmental potential. Although the molecular mechanisms for the generation of mature B- or T- lymphocytes are beginning to be revealed, a major unanswered question is how multipotent HSCs initiate commitment toward lymphoid fate. Our work indicates that specialized assemblies of ATP-dependent SWI/SNF chromatin remodeling complexes perform lineage-specific roles during hemopoiesis. Here we show that the Smarcd1 subunit is specifically required for the development of the lymphoid lineage. Deletion of Smarcd1 in adult hematopoiesis causes lymphopenia with near complete absence of progenitors and mature B/T-lymphocytes, whereas the myeloid and erythroid lineages remain unaffected. Smarcd1 is required to generate lymphoid-primed multipotent progenitors from HSCs, highlighting an essential role in early lymphoid specification. Transcriptomics analyses revealed a functional collaboration between Smarcd1 and the bHLH transcription factor E2A in activating the lymphoid-specific gene expression program. Mechanistically, we found that Smarcd1 physically interacts with E2A and is required for its recruitment at H3K27a/H3K4me1-enriched “active” enhancers coordinating the lymphoid gene signature. Altogether, these studies identify Smarcd1 as a chromatin remodeler that collaborates with E2A to specify lymphoid cell fate during hemopoiesis.

La Nucléophosmine (NPM1) est fréquemment mutée ou transloquée dans les leucémies myéloïdes aigües (LMA). NPM1 est nucléaire mais sa mutation récurrente NPMc+ induit un signal d’export nucléaire favorisant son accumulation cytoplasmique et son activité leucémogène. La translocation NPM-MLF1 mène aussi à une relocalisation cytoplasmique partielle. NPMc+ caractérise des LMA à bon pronostic tandis que NPM-MLF1 est un marqueur de mauvais pronostic. Notre hypothèse était donc que NPMc+ et NPM-MLF1 induisent la leucémie via différents mécanismes cellulaires. Puisque NPM-MLF1 est partiellement au noyau, nous avons étudié l’effet de NPM-MLF1 sur certains mécanismes nucléaires dans les cellules hématopoïétiques. L’intéractome protéique de NPM1 et NPM-MLF1 a montré leur association avec plusieurs sous-unités des complexes de remodelage de la chromatine NuRD, P/BAF et ISWI. NPM1 et NPM-MLF1 sont recrutées à la chromatine de gènes. Cependant, NPM-MLF1 induit une variation de la transcription et de l’accumulation du complexe NuRD à certains gènes. De façon intéressante, NPM-MLF1 et NPMc+ influencent différemment l’expression de ces gènes cibles. Finalement, nous observons des variations dans la composition de complexes de remodelage associés à NPM1 versus NPM-MLF1. Donc, les séquelles de NPM-MLF1 sont différentes de celles imposées par NPMc+. NPM-MLF1 induit une variation de l’expression génique en influençant le recrutement de complexes de remodelage et l’organisation de la chromatine.

Mes principaux travaux de recherche portent sur la compréhension de l'instabilité épigénétique survenant lors d’une perturbation dans l’établissement ou le maintien de la méthylation de l'ADN au cours du développement embryonnaire précoce. Mon laboratoire de recherche vise à comprendre comment, pendant le développement de l'embryon, un dérèglement du programme épigénétique peut être impliqué dans la survenue de troubles développementaux prénataux ou suivant la naissance. Nous utilisons des modèles de cellules souches embryonnaires dans lesquelles il est possible de contrôler l’expression d’ADN méthyltransférase (DNMT) afin de définir, à haute résolution, la chronologie et l’évolution de dérèglements épigénétiques (méthylation d’ADN, modifications d’histones) et transcriptomiques. Nous avons identifié un groupe de gènes (familles Xlr), qui comme les gènes à empreinte, doivent maintenir des niveaux constants de méthylation d’ADN au niveau de leur promoteur dans les cellules embryonnaires. Nous avons défini que la perte temporaire de DNMT1 cause un remodelage de la chromatine et une expression erronée des gènes Xlr. En utilisant une approche d’édition de l’épigénome nous étudions comment le remodelage de la chromatine empêche le rétablissement des profils normaux de méthylation d’ADN. Globalement, nos recherches approfondiront les connaissances sur les dérèglements initiés sur l'épigénome du jeune embryon, ainsi que sur l'évolution de ces dérèglements pendant le développement.

Le cancer du poumon est le cancer le plus mortel dans le monde avec environ 1,6 million de décès par année. La grande majorité des patients sont atteints de cancer du poumon non à petites cellules. De grandes avancées thérapeutiques ont été réalisées grâce à une plus grande compréhension de la physiopathologie permettant de cibler les patients ayant des mutations spécifiques particulièrement dans les gènes KRAS, ALK, ou EGFR. Malgré tout, la majorité de ces patients ne sont pas guéris à cause de mécanismes de résistance, de sorte que la survie des patients avancés est extrêmement faible, suggérant le besoin urgent de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques pour le cancer du poumon non à petites cellules. Suite à des criblages de petites molécules, nous avons identifiés que les protéines arginines méthyltransférases représentent des cibles de choix pour les stades avancés dans le cancer du poumon non à petites cellules. Les résultats seront discutés dans le cas d’approches combinatoires avec d’autres médicaments utilisés en clinique.