104 - Maladies infectieuses et immunitaires

De nombreux groupes ont récemment démontré que plusieurs virus pouvaient modifier l’épissage alternatif (ÉA) des transcrits cellulaires. Nous avons précédemment identifié plusieurs changements d’ÉA après l’infection par réovirus, un virus prometteur comme traitement contre le cancer. Puisque l’ÉA possède un rôle régulateur important et que ce mécanisme est perturbé dans le cancer, nous avons émis l’hypothèse que ces changements puissent être impliqués dans l’activité oncolytique du virus. Dans la présente étude, nous avons examiné les mécanismes permettant au virus d’induire ces changements de l’ÉA des ARN cellulaires. En comparant différents réovirus, des virus réassortis ainsi que des réovirus mutants, nous avons pu démontrer que cette modulation est variable d’une souche à l’autre, qu’elle est principalement contrôlée par la protéine μ2 du virus et que l’acide aminé en position 208 de cette protéine est critique pour induire ces changements. En utilisant une approche de spectrométrie de masse, nous avons identifié les protéines cellulaires interagissant avec μ2. Parmi celles-ci, nous avons validé par co-immunoprécipitation l’interaction de μ2 avec EFTUD2, SNRNP200, PRPF6, et PRPF8, qui appartiennent toutes à la particule U5 du complexe responsable de l’épissage, le splicéosome. Les études en cours visent à mieux comprendre comment l’interaction de μ2 avec ces protéines participe aux changements de l’ÉA et quel est le rôle de ces changements dans la réplication du virus.

Nous avons précédemment observé que les souris ayant une délétion conditionnelle de Shp-2 dans l’épithélium intestinal (Shp-2IEC-KO) développaient une colite spontanée. Un traitement aux antibiotiques atténue la sévérité de la maladie, suggérant qu’elle est dépendante des bactéries intestinales. Nous avons montré que la délétion concomitante de Myd88 retarde l’apparition de la colite chez les souris Shp-2IEC-KO. MyD88 est un adaptateur des récepteurs de type Toll (TLRs) reconnaissant des motifs moléculaires du microbiote. Ces données suggèrent que Shp-2 pourrait réguler la signalisation des TLRs dans les cellules épithéliales intestinales (CEIs). L’activation des voies des MAP Kinases et NF-kB en réponse aux ligands des TLRs dans les CEIs a donc été évaluée par immunobuvardage. Shp-2 est rapidement activée (phosphorylée sur Y542) après stimulation de 5 TLRs distincts. En réponse au LPS (ligand du TLR4) et à la flagelline (ligand du TLR5), l’activation des kinases ERK, JNK et p38 est réduite par l’inhibition pharmacologique de Shp-2 (SHP099) alors que celle de NF-κB est augmentée (dégradation de IκBα). Une analyse du phosphoprotéome dans des CEIs stimulées au LPS suggère que l’ubiquitine ligase Itch serait hyperphosphorylée sur tyrosine lorsque Shp-2 est inhibée. Itch est impliquée dans la dégradation de Tak1, l’activateur des voies NF-kB et MAPK. Ces données proposent pour la première fois un mécanisme de régulation de la signalisation des TLRs par Shp-2 dans les CEIs.

Avant l’apparition de la couche d’ozone (CO), les organismes étaient soumis à de fortes irradiations UV endommageant l’ADN. L’ADN étant le support de l’information génétique, sans réparation, le devenir de la cellule est incertain. Plusieurs organismes ont alors développé une défense commune afin d’assurer leur pérennité face aux dommages UV : la réparation par excision de nucléotides (REN).

Dépendamment de leur position dans l’ADN, la REN possède deux voies de reconnaissance des dommages. L’une, la réparation couplée à la transcription, répare le brin transcrit des gènes actifs, et l’autre, la réparation globale du génome (RGG), répare les gènes inactifs. Mais, de récents résultats laissent à penser que la RGG interviendrait également au niveau de la réparation du brin transcrit des gènes actifs. Ceci bouleverserait notre compréhension de la REN.

Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé une technique basée sur l’extension d’amorce d’ADN par l’ADN-polymérase, permettant d’étudier séparément la réparation du brin transcrit et non-transcrit des gènes actifs.

Les résultats préliminaires démontrent que la RGG répare aussi le brin transcrit des gènes actifs. Cette étude permettra de comprendre comment la cellule emploie les deux voies de la REN afin de répondre aux altérations induits par les UV. Ce sujet est d’autant plus d’actualité dans une dynamique où la quantité de rayons UV qui atteint la surface de la Terre augmente au fur et à mesure que la CO s’amincit.

La maladie d’Alzheimer est la première cause de démence à travers le monde et engendre un énorme fardeau humain et financier. Elle est caractérisée par la surproduction et l’agrégation de l’Amyloïde-Beta (Aβ), un petit peptide de longueur variable. Plusieurs études récentes lui attribuent un rôle antimicrobien afin de combattre des infections au système nerveux. La parodontite, une maladie inflammatoire de la bouche, est majoritairement causée par deux bactéries : P. gingivalis (Pg) et T. denticola (Td). Ces deux pathogènes sont connus pour produire une grande quantité de biofilm, une matrice permettant une résistance aux stress environnementaux. Notre hypothèse est donc que l’Aβ est produit en réponse à une infection par Pg et Td et que leur biofilm sert d’échafaudage afin d’exacerber l’agrégation du peptide. Nous étudions donc la relation entre le peptide et les composantes de la matrice bactérienne de Pg et Td. L’effet du peptide sur la formation du biofilm peut être observé avec des expériences de coculture. De plus, avec l’immunofluorescence, l’agrégation du peptide dans la matrice peut être caractérisée. Il sera éventuellement possible de cultiver Pg et Td en présence de lignées cellulaires afin de caractériser la production et l’agrégation du peptide. Une analyse de ces cultures nous permettra de dresser un profil métabolique de l’infection, servant au développement d’un outil de diagnostic précoce de la maladie d’Alzheimer aggravée par une infection bactérienne.

Problématique N. meningitidis est l'une des deux espèces de Neisseria pathogènes chez l'homme. Son génome est la cible de nombreux transferts horizontaux de gènes (HGT), conséquence directe de sa compétence naturelle qui lui permet de capturer de l'ADN étranger et de l'intégrer à son propre génome. Malgré son utilité, la régulation de la compétence est encore mal comprise. Cette étude s'intéresse à une protéine hypothétique surnommée GspA, dont plusieurs caractéristiques laissent croire qu'elle est impliquée dans la compétence naturelle et la virulence de N. meningitidis.

Objectifs et méthodologie Ce projet vise à caractériser la protéine GspA ainsi que ses fonctions chez N. meningitidis (Nm). Pour ce faire, des mutants de GspA ont été générés dans Nm et comparés in vivo lors de divers tests phénotypiques. La protéine a également été purifiée pour évaluer ses fonctions biochimiques.

Résultats GspA est une nouvelle endonucléase qui affecte fortement le taux de HGT chez Nm. Cette protéine est également très importante pour la virulence de la bactérie.

Retombées Cette étude met en lumière un tout nouveau mécanisme de régulation de la compétence naturelle chez les Neisseria, de même qu'un nouveau facteur de virulence de Nm, ce qui pourrait mener au développement d'autres approches thérapeutiques. À cause de sa structure particulière, la protéine GspA pourrait également faire partie d'une nouvelle famille d'endonucléases aux fonctions biologiques importantes.

La maladie granulomateuse chronique (CGD) est causée par des défauts génétique dans le NOX2 entraînant une diminution du ROS, dérivée des phagocytes. Les patients atteints de CGD ont des infections graves et 50 % d’entre-deux présentent une maladie inflammatoire de l’intestin. Le microbiome semble jouer un rôle important dans le CGD-IBD. Notre évaluation du microbiome intestinal des souris gp91^phox-/- résistantes aux modèles de colite chimique et infectieuse a montré que ces souris étaient colonisées par Mucispirillum schaedleri, un commensal intestinal qui aurait des propriétés à la fois protectrices et pathogènes selon l’environnement de l’hôte. Nous avons émis l’hypothèse que les souris gp91^phox-/-  étaient colonisées par une nouvelle souche adaptée à l’hôte de M. schaedleri (M.schaedleri-HA). Nous avons utilisé des méthodes de séquençage, de PCR, de profil métabolique et de culture cellulaire avec qPCR pour caractériser la nouvelle souche. Nous avons identifié 321 gènes uniques dans le métagénome de la souche M. schaedleri-HA et l’analyse qPCR révèle une augmentation de l’expression de gènes reliée à l’interaction hôte-pathogène dans la souche type M. schaedleri. Ces données suggèrent que la souche de M. schaedleri-HA induit une réponse hypo-inflammatoire dans les cellules hôtes par rapport à la souche type. Nous avons identifié une nouvelle souche qui a acquis de nouvelles propriétés fonctionnelles et qui peut conférer une protection dans le contexte de la colite CGD.

Des études ont montré que des pseudo-virus constitués des protéines d’assemblage du virus de la leucémie murine et de la protéine Spike de l’enveloppe virale du coronavirus se comportent comme des coronavirus sauvages en ce qui a trait à l’adhésion sur des surfaces inertes et l’entrée dans les cellules. De ce fait, nous utilisons une stratégie de co-transfection à 3 plasmides afin de produire les pseudo-virus chez des cellules productrices. L’assemblage des protéines qui sont produites par la co-expression des 3 plasmides génère des particules virales qui expriment à leur surface la protéine Spike. Après l’isolement des pseudo-virus et la détermination de leur titre, ils ont été soit utilisés directement (sans traitement) ou incubés en présence de nanoparticules de carboxymethyl cellulose couplées au cuivre (CMC-Cu) et ce, sans ou avec des agents désinfectants. Par la suite, les pseudo-virus ont été utilisés pour infecter les cellules pulmonaires VeroE6. Étant donné que le génome viral de ces pseudo-virus ne permet pas leur réplication lytique, il demeure intégré dans le génome des VeroE6 et l’expression du gène luc permet de quantifier l’efficacité de l’infection virale lorsque les pseudo-virus ont été préalablement exposés aux nanoparticules seules ou en combinaison avec des désinfectants. Collectivement, les résultats obtenus ont permis de définir les propriétés virucides du CMC-Cu pour contrer l’infection par les pseudo-virus exprimant la protéine Spike des coronavirus.