111 - Sida, grippe, Ebola, Zika... D’où viennent ces virus? Quels avancements de la science pour contrer ces maladies infectieuses?

Le dolutegravir (DTG) est un inhibiteur de l’intégrase (IN) avec une barrière de résistance plus élevée que d’autres inhibiteurs de l’IN. Chez les patients ayant déjà reçu des traitements  et in vitro, le DTG peut sélectionner des mutations premières qui ne sont pas observé chez des patients naïfs de traitements. Cela pourrait être expliqué par le fait que les mutations sélectionnées diminuent la capacité de réplication du virus. L’émergence de la substitution S230R a été décrite chez deux patients qui ont subi des échecs virologiques après avoir débuté la monothérapie avec le DTG. Ce projet caractérise l’effet du subsitution S230R sur l’activité enzymatique de l’IN, l’infectiosité du virus et résistance aux médicaments.

Les résultats des essais sans-cellules démontrent que comparer avec l’IN sauvage (Km = 8.8 ± 0.95), l’IN avec la substitution S230R possède un Km 2.22 fois supérieur (19.9 ± 2.3). Lorsque le DTG est présent, l’IN-S230R montre une réduction de 2.6 fois dans la susceptibilité au DTG. De plus, une diminution mineur dans la susceptibilité au bictegravir a été observé (Ki = 2.70 ± 0.49) comparé à l’IN sauvage (Ki = 1.84 ± 0.3). L’infectiosité du virus avec la substitution S230R dans l’IN a été diminuée par 65% comparé au type sauvage. En conclusion, l’échec virologique pendant la monothérapie avec le DTG peut se produire lorsque le virus avec la mutation S230R se reproduit et ce mutant démontre une résistance modeste au DTG et à d’autres inhibiteurs de l’IN.

L’existence de réservoirs cellulaires est un obstacle majeur pour l’éradication du VIH-1. Des données suggèrent que les macrophages contribuent à la persistance du VIH, mais le mécanisme de latence y est mal connu. Notre hypothèse est que les miARN jouent un rôle crucial dans la réplication et la latence du VIH dans les macrophages. Nous étudions deux miARN, l’un surexprimé et l’autre sous-exprimé lors de l’infection productive du VIH dans les macrophages. Dans un premier temps, nous validons l'interaction entre les miARN sélectionnés et leurs cibles. Pour cela, la séquence cible a été clonée en aval d'un gène rapporteur et les miARN sont exprimés à partir d’un plasmide. Nous avons transfecté le plasmide rapporteur et le plasmide codant pour le miARN dans différentes lignées cellulaires pour mesurer l’activité du miARN. Pour mettre en évidence les facteurs régulés par ces miARN, ils seront surexprimés dans des macrophages et l’expression des ARNm ciblés et des protéines qu’ils codent seront mesurées. Enfin, ces miARN seront coexprimés avec un clone moléculaire du VIH pour déterminer si ces miARN sont des facteurs de susceptibilité ou de résistance au virus. L'identification de miARN impliqués dans la réplication du VIH dans les macrophages aidera à comprendre quelles voies de signalisation jouent un rôle dans l’expression ou dans la latence du virus.

La simplicité et l’efficacité du système CRISPR-Cas9 sont grandement responsables de l’engouement actuel pour l’édition génomique, entre autres pour élaborer différentes approches de traitement du SIDA par thérapie génique. La protéine humaine TRIM5α, un effecteur de l’immunité innée antirétrovirale, intercepte le VIH-1 peu de temps après son entrée dans la cellule, lorsque deux mutations ponctuelles (R332G-R335G) sont apportées dans son domaine PRYSPRY. Notre objectif est d’effectuer l’édition génomique du gène TRIM5 par recombinaison homologue dirigée afin que des lignées cellulaires humaines expriment la version mutante de TRIM5α à des niveaux endogènes, sans expression constitutive de la nucléase Cas9. Après transfection de cellules HEK293T avec les composantes de CRISPR et un ADN « donneur », la détection de l’ADN recombiné par PCR spécifique a permis d’identifier des clones positifs. Le séquençage de ceux-ci par Illumina a révélé qu’ils étaient hétérozygotes avec un « indel » au niveau des allèles non recombinés, et leur restriction du VIH-1 n’était pas améliorée. Le même procédé d’édition génomique a été appliqué sur des cellules lymphocytaires Jurkat, et l’identification des clones positifs est en cours. À long terme, différentes combinaisons de matériaux et techniques d’acheminement de ceux-ci seront testés pour élaborer la méthodologie permettant une édition homozygote du gène TRIM5 dans des lignées cellulaires humaines menant à une résistance au VIH-1.

Selon l’Organisation mondiale de la santé, plus de 36 millions d’individus sont infectés par le VIH. Les traitements antirétroviraux (TAR) contrôlent la réplication du virus et la progression de l’infection mais ne peuvent pas guérir l’infection par le VIH. De nouvelles stratégies sont en développement et la modification des cellules souches hématopoïetiques en est une. Une transplantation de cellules souches de la moelle osseuse d’un individu résistant au VIH a guéri un patient infecté. Par contre, les transplantations de cellules allogènes sont associées à de forts taux de mortalité et les donneurs compatibles résistants sont rares. La transplantation de cellules autologues modifiées pour être résistantes au VIH est une alternative prometteuse.  Plusieurs ARN thérapeutiques ont été développés et peuvent  conférer la résistance au VIH quand elles sont exprimées dans les cellules du patient à l’aide de vecteurs rétroviraux.  Cependant, leur efficacité et leur toxicité n’ont pas été comparées. Nous avons étudié des meilleurs représentants de quatre classes d’ARN [petits ARN en épingle à cheveux (ARNsh), aptamères, ribozymes, et ARN U1 interférant (U1i)]. Nos résultats suggèrent que l’inhibition de la réplication du VIH par des ARN U1i et des ARNsh est supérieure à celles des aptamères et des ribozymes. Nos résultats aideront à choisir les molécules ARN les plus appropriées pour les transplantations de cellules autologues modifiées dans le cadre de la guérison du VIH.

Le virus Zika (ZIKV) est un agent pathogène transmis par les moustiques et découvert en 1947. Dû à une apparente faible morbidité, peu de recherché fut effectuée dans le passé. Récemment, ZIKV a été confirmé comme circulant activement au Brésil et s’est répandu rapidement dans les Amériques. La transmission sexuelle a rapidement été identifiée comme une possibilité et des recherches plus approfondies en laboratoire ont révélées que des souris immunodéficientes susceptibles à l’infection qui y survivaient, montraient des signes de dommages macro- et microscopiques aux testicules, entraînant une réduction de la fertilité.

Pour freiner la propagation du virus et les complications associées, plusieurs candidats de vaccins ont été développés et le premier à avoir atteint l’essai clinique de Phase I est GLS-5700, un vaccin à ADN qui a été démontré comme protecteur à 100% contre la mort et la perte de poids associée à l’infection chez la souris. Le but de la présente étude est de démontrer que ce vaccin peut aussi prévenir la diminution de fertilité suite à l’infection. Les animaux vaccinés ont effectivement été protégés contre la perte de fertilité contrairement à ceux non-vaccinés mais surprenant, ce dernier groupe n’a pas démontré de dommages testiculaires, tel qu’attendu dans ce modèle animal. Nous rapportons dans cette étude les effets de ZIKV sur la fertilité en absence de dommages testiculaires ainsi que l’efficacité d’une mesure prophylactique sur la prévention de ces effets.

La protéine humaine DDX3X est une ARN hélicase ATP-dépendante impliquée dans la régulation de plusieurs activités cellulaire tels que la transcription, la maturation et l'exportation ainsi que la traduction d'ARNm. DDX3X module de manière concomitante la réplication de plusieurs virus ARN et favorise l'immunité innée. Nous avons montré que le DDX3X – incorporé dans les particules matures du virus de l'herpès simplex de type 1 (VHS-1) qui est un virus à ADN - est nécessaire pour l’infection des cellules. Ici, nous montrons que le taux de DDX3X dans les cellules module l'expression des gènes viraux et donc sa réplication ainsi que sa propagation. De manière surprenante, le DDX3X incorporé dans les particules virales entrants n'était pas nécessaire pour les premiers stades de l'infection mais contrôlait plutôt l'assemblage des nouvelles particules virales et cela indépendamment de la capacité précédemment rapportée de DDX3X à stimuler la production d'interféron de type I. Cependant, l'absence ainsi que la surexpression de DDX3X perturbent la transcription des gènes viraux et donc la réplication subséquente du génome. Ceci suggère qu'en plus de son effet sur les virus à ARN, le DDX3X affecte des virus d'ADN tels que HSV-1 par une voie indépendante d'interféron.

Beaucoup de Flaviviridae, famille de virus enveloppés à ARN simple brin de polarité positive (ARNv), constituent des enjeux de santé publique importants. Le virus de l’hépatite C (VHC), un Hepacivirus touchant plus de 200 millions de personnes dans le monde ou encore les Flavivirus comme le virus de la dengue (VDEN), causant l’arbovirose la plus prévalente, et le virus Zika  (VZIK) associé à des microcéphalies congénitales, en sont très représentatifs.

La similarité générale entre leurs cycles viraux suggère qu’ils pourraient détourner des cofacteurs cellulaires communs. En nous basant sur nos travaux qui ont mis en lumière des complexes RNP cellulaires impliqués dans le cycle de réplication du VHC, nous évaluerons si ces facteurs sont exploités par VDEN et VZIK afin de réguler l’équilibre entre la réplication de l’ARNv et son encapsidation.

En utilisant différents systèmes rapporteurs infectieux, nous étudierons l’impact de l’invalidation et l’atténuation géniques de 17 cofacteurs cellulaires du VHC sur la réplication de l’ARNv du VDEN et du VZIK et de son encapsidation dans les virions néosynthétisés. A cette fin, nous exploiterons des techniques d’hybridation d’ARN in situ et d’immunomarquage combinées aux microscopies confocale et électronique.

Si l’utilisation de ces cofacteurs est conservée chez les Flaviviridae, ces derniers pourraient représenter de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le développement d’antiviraux à large spectre.

Les infections par le virus de la dengue (VDEN) et le virus Zika (VZIK), tous deux des flavivirus transmis par les moustiques de type Aedes, constituent un enjeu de santé publique majeur dans le monde. Le développement de drogues antivirales (pour l’instant inexistantes) représente un défi de taille qui est en partie dû à notre compréhension très modeste des mécanismes moléculaires régissant le cycle réplicatifs des flavivirus et de leur pathogenèse.

Suite à leur entrée dans la cellule, les flavivirus remodèlent les organelles membranaires cytoplasmiques et induisent la biogenèse des usines de réplication virales à partir du réticulum endoplasmique (RE). Par ailleurs, nous avons récemment démontré que la protéine virale NS4B induit une élongation drastique des mitochondries, lesquelles font des contacts avec les usines de réplication et ce, avec un impact proviral. Ceci est accompagné d’une altération massive des contacts entre le RE et les mitochondries résultant en une atténuation de la signalisation précoce de l’immunité innée. 

Ces stratégies de contrôle de l’hôte partagées par le VDEN et le VZIK pourraient ultimement représenter de nouvelles cibles pour le développement de thérapies pan-flavivirales. Nous présenterons des expériences visant à mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la modulation fonctionnelle de l’interface réticulo-mitochondriale par le VDEN et le VZIK (notamment au niveau de leur réplication virale et de l’immunité innée). 

En raison d’un taux de mutation élevé et du réassortiment génétique entre différentes souches, les virus influenza sont à la base respectivement des épidémies annuelles et pandémies grippales. La grippe cause en moyenne 3500 décès et 12000 hospitalisations au Canada sur une base annuelle. Les 2 principaux moyens pour lutter contre ce fléau demeurent la vaccination et l’utilisation d’antiviraux. Cependant chaque stratégie est associée à d’importantes limitations notamment la faible efficacité des vaccins inactivés actuels et l’émergence de souches virales résistantes aux antiviraux. L’objectif de cette présentation consiste à réviser et évaluer les nouveaux types de vaccins anti-grippaux (haute-dose antigénique, adjuvantés, vivants atténués, VLP, universels) ainsi que les nouvelles molécules antivirales (inhibiteurs de la neuraminidase, de la polymérase ou du récepteur cellulaire) récemment commercialisés ou en développement.

Le développement des médicaments antiviraux a permis de sauver des millions de vies. À l’origine ils étaient utilisés en monothérapie, ce qui était associé avec un haut taux d’échec thérapeutique et à l’émergence fréquente de mutations de résistance aux médicaments. La thérapie antiretrovirale de combinaison (ART) a permis de réduire dramatiquement le problème de la résistance et d’allonger de manière significative la durée de suppression virale chez la plupart des personnes vivant avec le VIH. Les médicaments se sont multipliés et sont devenus moins toxiques mais le problème de la résistance n’a jamais disparu. Dans l’ère nouvelle des inhibiteurs d’intégrase, les chemins de résistance peuvent être complexes et doivent être surveillés étroitement. Parmi ces nouveaux médicaments, le dolutegravir semble unique pour son efficacité contre l’émergence de mutations de résistance. En utilisant l’exemple du dolutegravir, je formulerai l’hypothèse qu’il existe des liens entre la résistance aux médicaments et les réservoirs viraux. 

Les ARN-polymérases ARN-dépendant des virus de la famille des Flaviviridae sont des cibles attrayantes pour le développement d’agents antiviraux du fait de leur conservation évolutive et fonctionnelle. Afin d’identifier des inhibiteurs des virus Zika (ZIKV) et Dengue (DENV), nous avons cloné les polymérases de ces deux virus, et nous avons développé des méthodes biochimiques pour mesurer leur activité. Nous avons également développé des méthodes nécessaires pour quantifier la réplication de ces deux virus en culture cellulaire.

Nous avons ainsi identifié plusieurs composés qui inhibent de manière efficace l’activité des polymérases in vitro et la réplication virale dans les cellules. De plus, nous avons montré que le Sofosbuvir (SFB), un médicament anti-virus de l’hépatite C (VHC) fabriqué par Gilead, inhibe également les réplications virales de ZIKV et DENV. Néanmoins, des concentrations 3 fois plus élevées de SFB sont nécessaires pour inhiber ces virus par rapport à l’inhibition du VHC.

Le virus de la Dengue menace près de la moitié de la population mondiale et l’épidémie récente de Zika montre le besoin crucial d’un médicament pouvant être utilisé par les femmes enceintes. Une étude des effets secondaires du SBV chez des femmes tombées enceintes alors qu’elles  l’utilisaient contre le VHC pourrait nous renseigner sur de potentiels effets tératogènes.

Avec près de 37 millions de personnes infectées dans le monde et près de 2.1 millions de nouvelles infections par année, la pandémie du VIH/SIDA demeure un problème majeur de santé mondiale. Dans les pays occidentaux, on estime à 2.4 millions le nombre de personnes vivant avec le VIH et à 91 000 le nombre de nouvelles infections par année. Il est généralement accepté que seul un vaccin efficace contre ce virus permettrait de contrôler cette épidémie qui fait 1.1 millions de morts par année. Malgré des efforts majeurs en ce sens, il n’y a toujours pas de vaccin efficace contre le VIH.  Nous ferons un retour sur les différents essais vaccinaux contre le VIH qui ont eu lieu dans le passé.  Nous décrirons quelques difficultés majeures qui empêchent le développement d’immunogènes efficaces contre ce virus.  Nous finirons en faisant un portrait des approches les plus prometteuses ayant le potentiel d’aboutir dans un vaccin efficace.

Les infections constituent une des deux plus grandes causes de mortalité mondiale, tuant deux fois plus que les cancers. Moins de 1500 maladies infectieuses ont été détectées et il est estimé qu'approximativement 320 000 pathogènes restent à être découverts. Cette présentation va décrire une structure de réponse aux infections rapide et innovante, basée sur une multitude d'expertises en recherche fondamentale, appliquée et clinique. Elle parlera aussi de la réponse aux épidémies à virus Ébola ainsi que du développement de vaccins et de traitements en situation d’urgence.

L’amélioration des vaccins existants et le développement de nouveaux vaccins passent par une connaissance accrue de la réponse immunitaire et des mécanismes de protection induits suite à l’immunisation.

Traditionnellement, les vaccins ont généralement été développés de façon à favoriser la synthèse d’anticorps, idéalement neutralisants. Plus récemment, la réponse cellulaire, un autre axe important de la réponse immunitaire, a fait l’objet d’un intérêt grandissant.
La réponse cellulaire joue un rôle particulièrement important lors de la protection croisée contre de nouvelles souches de virus influenza. La réponse cellulaire joue également un rôle majeur dans la protection des personnes âgées. En effet, avec l’âge notre capacité à produire des anticorps diminue et la protection contre les infections dépend de plus en plus des autres axes de la réponse immunitaire dont la réponse cellulaire.  

Bien qu’ayant fait l’objet d’études moins nombreuses, les différents vaccins contre le virus Ebola induisent une réponse cellulaire à des degrés divers. Le rôle de cette réponse dans la protection reste une question de première importance mais il ressort des études menées notamment chez les primates non-humains que la coopération entre les différents axes de la réponse immunitaire (humorale et cellulaire) est souhaitable afin d’assurer une protection optimale et durable.