107 - L’ARN, de la molécule aux maladies humaines

La dystrophie myotonique, la forme la plus répandue de dystrophie musculaire, est caractérisée par une perte musculaire progressive, une myotonie, de l’arythmie cardiaque et des problèmes respiratoires. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est causée par une expansion de triplets CTG dans la région 3’UTR du gène DMPK. L’accumulation de triplets CUG dans l’ARNm DMPK (DMPK-CUGn) résulte en une rétention nucléaire de ce transcrit et son agrégation sous forme de foci. L’hypothèse d’un ARNm DMPK-CUGn toxique suggère que ces foci d’ARN nucléaires séquestrent des protéines essentielles et affectent leurs fonctions cellulaires. Une de ces protéines est le facteur d’épissage Mbnl1, qui s’accumule dans les foci d’ARNm DMPK-CUGn, ce qui résulte en un défaut d’épissage alternatif de plusieurs ARNm régulés par Mbnl1 chez les patients DM1.

Cependant, plusieurs études suggèrent la présence d’autres mécanismes que la dérégulation de l’épissage des ARNm dans la pathogénèse de la DM1. Notre laboratoire étudie le rôle des ARN non-codants dans la pathogénèse de la DM1. Nous présenterons nos travaux sur un cluster de microARN surexprimés dans les muscles squelettiques de patients DM1 et de souris modèle de la DM1. Ce cluster, qui joue un rôle important dans la myogénèse, est contrôlé par un long ARN non-codant, dont l’expression et l’épissage sont dérégulés dans la DM1. Nous présenterons aussi nos travaux sur l’étude d’inhibiteurs pharmacologiques ciblant l’expression de l’ARNm DMPK mutant.

Nos études portant sur le rôle de Staufen1 dans le muscle squelettique ont montré que Staufen1 s'accumule à la jonction neuromusculaire, où son expression varie selon l'état d'innervation (Bélanger et al., 2003). Nos travaux plus récents ont révélé que l'expression de Staufen1 est nettement augmentée dans les échantillons musculaires de patients souffrant de dystrophie myotonique de type 1 (DM1), et dans des modèles de souris DM1, et que Staufen1 régule l'épissage des pré-ARNm du récepteur de l'insuline et du canal chlore (Ravel-Chapuis et al., 2012). Des analyses RT-PCR à haut débit sur myoblastes DM1 humains ont en outre montré que Staufen1 a un large impact sur plusieurs évènements d'épissage alternatifs (Bondy-Chorney et al., 2016). De plus, nous avons observé que les niveaux de Staufen1 diminuent au cours du développement musculaire et que l'expression soutenue de Staufen1 affecte négativement la différenciation myogénique en contrôlant la traduction de c-myc (Ravel-Chapuis et al., 2014), un processus que nous observons aussi dans les rhabdomyosarcomes (Crawford et al., 2017). Enfin, nous avons observé que Staufen1 est recruté dans les granules de stress dans des myoblastes contrôles. En revanche, les myoblastes DM1 forment de tels granules moins efficacement (Ravel-Chapuis et al., 2016). Collectivement, nos résultats montrent que Staufen1 est un nouveau régulateur de l'épissage qui assume de multiples fonctions additionnelles dans le muscle squelettique sain et malade.

Très peu est connu sur la manière dont les protéines liant l'ARN coordonnent le destin de l’ARN lié.  Plusieurs protéines de liaison à l’ARN dont TDP-43 et hnRNP A1 sont mutées dans des cas familiaux de sclérose latérale amyotrophique (SLA) et on les retrouve dans des inclusions cytoplasmiques. Notre hypothèse est que la mauvaise localisation de TDP-43 perturbe ses fonctions nucléaires. Nous rapportons que TDP-43 lie l’ARNm d’ hnRNP A1 et module l’épissage de l’ARN pré-messager. La diminution nucléaire de TDP-43 entraîne une augmentation dans l’inclusion de l’exon 7B et a pour conséquence un niveau protéique plus élevé  de l’isoforme le plus long appelé hnRNP A1B. L’exon supplémentaire code 52 acides aminés qui allongent le domaine riche en glycine. Nous avons démontré que l’allongement du domaine confère une plus grande propension à la fibrillisation et entraîne l’agrégation des protéines. On sait peu de choses sur la signification biologique de la protéine hnRNP A1B qui est de faible abondance. Nos données indiquent que l’expression de cet isoforme diminue la survie cellulaire. Enfin, nous avons observé une accumulation d’hnRNP A1B dans des cas de SLA chez l’homme avec une pathologie TDP-43 documentée. Nous proposons que la perte nucléaire de TDP-43 contribue à la vulnérabilité neuronale par des modifications dans l’épissage alternatif d’hnRNP A1 et de ses fonctions. Ce lien entre hnRNP A1 et TDP-43 démontre un nouveau mécanisme moléculaire dans la pathogenèse de la SLA.

Il y a déjà quelques années, nous avons développé la méthode ARiBo pour la purification par affinité d’ARN produits in vitro et avons démontré que cette nouvelle méthode permet la purification rapide d’ARN sous forme native avec de bons niveaux de rendement et de pureté. Depuis, la méthode ARiBo a été optimisée pour capturer des protéines d’un extrait cellulaire qui lient un ARN cible. Pour ces expériences de pull-down d’ARN, les tige-boucles présentes dans les formes immatures des microARN (miARN) de la famille let-7 (let-7-a-1 et let-7g) ont été utilisées comme ARN cible. La méthode de pull-down ARiBo a été optimisée pour produire à la fois de bons rendements de purification et très peu de contaminants provenant de la liaison non-spécifique de protéines. L’analyse par spectrométrie de masse quantitative a permis l’identification des protéines qui s’associent de façon spécifique à ces tige-boucles. Plusieurs protéines déjà connues pour s’associer aux formes immatures des miARN let-7 ont été identifiées, mais avec une meilleure couverture comparativement aux études précédentes. De plus, plusieurs nouvelles protéines ont été identifiées et, de ce fait, nos travaux contribuent à mieux définir l’interactome protéique des tige-boucles des miARN let-7. Bref, en combinant la méthode de purification ARiBo and avec la spectrométrie de masse quantitative, nous avons conçus une approche protéomique efficace qui permet d’identifier des protéines associées à un ARN cible.

Les voies ARNi initiées par l'ARN double brin ont récemment émergé comme des acteurs majeurs dans les processus oncogéniques allant de la tumorigenèse, à l'angiogenèse, à la progression de la tumeur et à une résistance au traitement. Ces mécanismes de régulation des gènes, tels ceux gouvernés par les microARNs, sont si importants qu'ils sont souvent modifiés, amplifiés, ou supprimés sous les pressions sélectives qui prévalent au sein des tumeurs.

Nos résultats indiquent que la biogenèse du polycistron de microARNs miR-17-92, un locus proto-oncogénique, est profondément altérée lors de son amplification dans des lymphomes et dans certains sous-types de cancer de poumon. Un examen approfondi des évènements qui gouvernent sa maturation révèle que l’accumulation de son transcrit primaire et d’autres intermédiaires immatures provoque une saturation du complexe Microprocesseur (Drosha/DGCR8 et co-facteurs). À son tour, cette saturation résulte en l’inhibition de la biogenèse et de la fonction de microARNs suppresseurs de tumeur.

Nos travaux illustrent l’importance des défauts de biogenèse des microARNs dans la réorganisation des réseaux de régulation des gènes dans le cancer.

La médecine a été marquée dans les dernières années par l’arrivée d’une nouvelle classe de molécules. Les microARN (miARN), petits ARN d’une vingtaine de nucléotides, ont démontré leur potentiel dans tous les contextes cliniques inimaginables. Puisqu’un miARN a la capacité d’inhiber simultanément la traduction de centaines de gènes différents, il n’est pas étonnant que leur dérégulation soit impliquée dans la majorité des maladies humaines. Détectables par centaines dans les liquides biologiques tels que le sang et l’urine en plus des biopsies, leur étonnante stabilité fait d’eux des marqueurs de choix pour nos laboratoires. Nous sommes intéressés par le potentiel diagnostique et thérapeutique des miARN dans le contexte de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). La DMLA est la première cause de cécité dans les pays développés chez la population de 50 ans et plus. Nous avons identifié un profil d’expression spécifique de miARN dans le vitré et le sang de ces patients. Basé sur cette signature, nous avons ciblé ces petits ARN dans des modèles murins afin de diminuer la néovascularisation, processus au cœur de la maladie. Finalement, nous  avons investigué l’impact des polymorphismes nucléotidiques spécifiques à la DMLA sur les réseaux de régulation impliquant les miARN.