105 - La recherche en vue d’une guérison du VIH : les efforts scientifiques d’ici et d’ailleurs

Le CD154 est une molécule pro-inflammatoire impliquée dans plusieurs pathologies. Elle peut être sous deux formes, soluble et membranaire. Le CD154 interagit avec le CD40 et les intégrines αIIbβ3, α5β1 et αMβ2 connues pour jouer un rôle dans la prolifération et la survie cellulaire. Cependant, le rôle de leur interaction avec le CD154 reste peu étudié.

Hypothèse : l’interaction du CD154 avec les intégrines est impliquée dans les réponses immunitaires et augmente le potentiel inflammatoire de cette molécule dans les pathologies.

Objectifs :1) Étudier le rôle de l’interaction du CD154 avec l’α5β1 dans la survie des cellules T. Ici on a induit l’apoptose via Fas dans les cellules T, puis évalué l’effet du CD154 envers cette réponse apoptotique. 2) Vu l’interaction déjà documentée du CD154 soluble avec les integrines, nous visons à étudier l’interaction du CD154 membranaire avec ces dernières, plus spécifiquement  avec l’α5β1 par microscopie à fluorescence, Western blot et cytométrie en flux. 3) Étudier le rôle de l’interaction CD154 avec ses récepteurs dans un modèle in vivo d’arthrite au collagène dans les souris CD154-/-.

Résultats: le soluble CD154 inhibe la mort induite via Fas dans les cellules T. Également, seul le soluble CD154 peut interagir avec l’α5β1. Ce travail permettra la compréhension du rôle biologique du CD154 avec ses récepteurs dans les réponses immunitaires et envisager une cible thérapeutique pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde.

Le VIH mène à l’épuisement des fonctions de lymphocytes T pour lequel l’implication des récepteurs inhibiteurs (RIs) est peu connue, entre autres dans le cas des T CD4+ spécifiques au VIH (T CD4_VIH). Nous comparons donc ici l’expression de RIs sur des T CD4_VIH épuisés de progresseurs chroniques (PC) versus ceux fonctionnels de contrôleurs élites (CE).

Nous avons recueilli des PBMC de sujets VIH+ non-traités avec une virémie contrôlée (9 CE) ou non (11 PC). Nous avons identifié les T CD4_VIH par la co-expression en surface de marqueurs d’activation (CD69, CD40L) après 9 heures de stimulation in vitro avec des peptides du VIH (Gag, Env) ou de CMVpp65. Leur phénotypage par cytométrie en flux a démontré une fréquence plus élevée des RIs PD-1 (85% vs 65%; P*), TIGIT (63% vs 36%; P**) et CD200 (62% vs 28%; P**) chez les T CD4_VIH de PC vs CE. L’expression de TIGIT et CD200 est plus fréquente chez les T CD4_VIH que chez les T CD4_CMV d’un même sujet. Contrairement aux T CD4_CMV, les T CD4_VIH tendent vers un phénotype CXCR5+CD45RA- et CXCR5+CD45RA-PD-1+ (T auxiliaires folliculaires périphériques ; pTFH) chez les PC et les CE, avec plus de RIs sur les pTfh que les non-pTfh.

L’analyse des T CD4_VIH par notre méthode démontre donc que leur dysrégulation est caractérisée par une hausse des RIs TIGIT, CD200 et PD-1 accompagnée d’un biais vers le lignage CXCR5+. Ceci témoigne ainsi la pertinence de l’immunothérapie par coblocage de RIs afin de renverser l’épuisement lié au VIH.

Malgré des traitements antirétroviraux (ARV) contrôlant efficacement la réplication virale, l’éradication du VIH n’est pas atteinte. L’ADN intégré du VIH persiste et la réplication virale reprend dès l’arrêt du traitement. Alors que la persistance des réservoirs viraux dans les cellules T CD4+ est bien étudiée, la contribution des cellules myéloïdes est peu définie. Nos études, réalisées sur des cellules myéloïdes du sang d’individus VIH+ traités, ont démontré la présence de retro-transcrits précoces du VIH (RU5), mais pas d’ADN intégré, dans les monocytes totaux de 3/13 participants VIH+. Des niveaux faibles de réplication virale ont été détectés suite à la coculture de ces monocytes avec des cellules T CD4+ activées VIH-, suggérant la persistance d’un faible niveau de VIH capable de réplication dans les monocytes. Comparés aux monocytes classiques CD16-, les monocytes intermédiaires/non classiques CD16+ portent préférentiellement de l’ADN viral non-intégré, suggérant une exposition au VIH in vivo malgré le traitement. Finalement, au niveau intestinal, la présence d’ADN viral non-intégré a été détectée dans les cellules myéloïdes de 1/13 participants. Ces résultats supportent la contribution mineure des cellules myéloïdes circulant dans le sang et infiltrant l’intestin à la persistance du VIH sous thérapie ARV. L’accès à des sanctuaires anatomiques riches en cellules myéloïdes d’origine embryonnaire versus monocytaire  sera nécessaire pour des investigations futures.

La réponse immunitaire à médiation cellulaire dirigée contre la protéine Gag joue un rôle-clé dans le contrôle de la réplication du VIH chez les adultes et les enfants. Nous avons examiné la relation entre la réponse T Gag-spécifique et l’intégralité et la durée de la suppression virale soutenue (SVS) chez un groupe d’enfants infectés par le VIH (n=51) et traités au moyen de thérapie antirétrovirale combinée (TAC). Des cellules du sang veineux ont été utilisées dans des tests ELISpot pour mesurer la production d’IFN-g suite à une stimulation avec des panels de peptides appariés à la souche du virus infectant. L’amplitude de la réponse (cumulative et médiane) et son spectre de reconnaissance (proportion des pools générant une réponse) ont été comparés en fonction de l’âge et de la durée de la SVS sous TAC. Une association statistiquement significative a été relevée entre l’âge (médiane=13.7 ans, écart interquartile [EI]=9.99-16.4 ans) et l’amplitude de la réponse Gag spécifique (cumulative: p=0.0011; médiane: p=0.0015; test de Spearman) et entre l’âge et le spectre de reconnaissance (p=0.0004). La proportion de vie sous TAC menant à une SVS (PVTS; médiane=37.8%, IE=13.2-67.6%) était inversement proportionnelle à l’amplitude (cumulative: p=0.0008; médiane: p=0.0237) et au spectre (p=0.0247). Ces résultats indiquent que la réponse anti-VIH à médiation cellulaire évolue avec l’âge, et que la PVTS est un robuste prédicateur négatif de l’amplitude et du spectre de cette réponse.

L’habilité du VIH d’établir une infection systémique et persistante est liée en grande partie à sa capacité de coder pour des protéines « accessoires » dont le rôle est de cibler des facteurs de l’hôte pour échapper à ses réponses immunitaires. La protéine virale R (Vpr) est celle dont la fonction et les cibles cellulaires restent encore énigmatiques. Elle cause un arrêt du cycle cellulaire en G2/M dans les cellules en division et confère un avantage réplicatif au virus lors de l’infection des macrophages ; bien que distinctes, un lien génétique entre ces fonctions semble exister. Nous utilisons l’approche d’identification de partenaires par biotinylation (BioID) afin d’élucider l’intéractome de Vpr et ainsi comprendre son rôle dans les mécanismes de persistance du VIH. Cette approche, basée sur une fusion de Vpr avec une biotine ligase (BirA*), permet la biotinylation in cellulo des partenaires de Vpr, puis leur identification par spectrométrie de masse. Lors de l’analyse, nous retrouvons deux protéines essentielles à l’arrêt de cycle induit par Vpr, DDB1 et DCAF1, confirmant ainsi sa validité. Nous avons aussi identifié des complexes protéiques associés à la réparation des dommages à l’ADN et au cycle cellulaire. Une meilleure connaissance des cibles et partenaires cellulaires de Vpr permettra de mieux définir son rôle fonctionnel et sa contribution aux mécanismes de persistance du VIH tout en identifiant des éléments de sa biologie applicables à des fins thérapeutiques.

Introduction: La thérapie antirétrovirale (ART) a transformé la vie de millions de personnes en supprimant la réplication virale et en réduisant les risques des événements liés/non liés au SIDA et la transmission secondaire. L'initiation précoce de l’ART représente donc la stratégie la plus importante pour lutter contre l'épidémie VIH. Nous avons évalué les facteurs associés à l'initiation précoce de l’ART pendant l'infection primaire à VIH (PHI) à Montréal.

Méthodes: Les participants à l'Étude PHI de Montréal (18+ ans), ont été classé comme recevant un traitement ART précoce si initié <180 jours pour examiner les associations entre l'initiation précoce de l’ART et les facteurs socio-économiques et cliniques.

Résultats: L'âge médian de 348 participants était de 35 ans et la majorité était des hommes (96%), ayant un emploi rémunéré (63%) et des HSH (78%). Ils présentaient une charge virale de 4,6 log10 copies/mL, des CD4 à 510 cellules/μL et ont été recrutés dans des centres médicaux communautaires (52%) ou des centres médicaux universitaires (CMU, 48%). L'initiation précoce de l’ART observée chez 47% des participants été associée de façon indépendante à l'état d'emploi, au nombre plus faible de CD4 et aux soins dans les CMU.

Conclusions: Outre les facteurs pronostiques, l'initiation précoce de l’ART a également été liée à des facteurs socio-économiques, qui sont à considérer pour atteindre les objectifs de l'ONUSIDA de 90-90-90 et finalement contribuer à la guérison du VIH.

Les pDCs jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires antivirales via la sécrétion de taux élevés d'interférons de type I (IFN-I) et d'autres cytokines. Bien que l’IFN-I semble avoir un rôle protecteur durant les phases précoces de l’infection, il n’est pas clair si les  pDCs contribuent à ces processus d’autant plus que l'infection par le VIH favorise une redistribution des pDCs vers les tissus lymphoïdes où ces cellules subissent une déplétion par apoptose. Le CDX-301 est une forme recombinante du ligand Flt3L. La liaison du CDX-301 au récepteur Flt3, exprimé sur les précurseurs myéloïdes et lymphoïdes, induit la prolifération, la différenciation et la mobilisation des DC dans le sang périphérique et les tissus lymphoïdes. En utilisant des modèles de souris humanisés NSG, nous avons testé si CDX-301 induit un contrôle de la réplication et de la pathogenèse du VIH. Par ailleurs, à travers des études de déplétion des pDCs (anti-BDCA2), nous avons analysé la contribution spécifique des pDCs aux effets induits par CDX-301. Nos résultats indiquent que l'expansion des pDCs in vivo via CDX-301 facilite le développement de réponses antivirales efficaces contre le VIH. L’identification du mécanisme responsable du contrôle de la réplication du VIH par les pDCs est actuellement en cours. Ces résultats indiquent un rôle protecteur des pDCs durant l’infection précoce par le VIH et suggèrent une nouvelle approche potentielle pour prévenir le développement des réservoirs viraux.

Nous avions précédemment montré que le retrait d’inhibiteur de l’intégrase lors de la phase précoce de l’infection de cellules par le VIH-1 entrainait une reprise de la réplication virale plus lente avec dolutégravir (DTG) qu’avec raltégravir (RAL).

Des cellules MT-2 traitées avec DTG, RAL ou elvitégravir (EVG) ont été infectées par la souche sauvage NL4.3 du VIH-1 ou contenant les substitutions R263K ou G140S/Q148H, et les drogues ont été retirées du milieu de culture 3 jours après le début de l’infection. La réplication virale a été suivie par activité Transcriptase Inverse dans les surnageants, l’intégration virale et la synthèse des cercles à 2-LTR mesurées par qPCR.

Avec le virus sauvage, l’intégration n’a pas immédiatement redémarré après retrait du DTG ; celle-ci était 2 fois plus élevée que dans la condition où la drogue était maintenue 8 jours après retrait lorsque le RAL était utilisé. Des résultats similaires ont été obtenus pour le DTG et le RAL lorsque le virus contenant R263K a été utilisé. Avec le virus résistant contenant G140S/Q148H, les niveaux d’intégration étaient aussi hauts que ceux du témoin sans drogue lorsque le RAL ou l’EVG ont été utilisés ; avec le DTG, ils étaient environ 45 fois plus bas au jour 3 de l’infection. L’intégration a redémarré après retrait de la drogue mais restait tout de même basse 8 jours après retrait.

La difficulté pour trouver un remède à la guérison du VIH de façon permanente reste la latence virale. Or, cette latence s’établit relativement tôt lors du processus de pathogenèse du SIDA. Tout le mécanisme de latence est contrôlé au niveau moléculaire par des activateurs et des répresseurs qui s’installent au niveau du promoteur viral. Plus spécifiquement dans le promoteur de base viral, des motifs CTGC proches de la boite TATA sont responsables pour l’assemblage du complexe de préinitiation du VIH (PICH). L’architecture spécifique du promoteur de base du VIH est essentielle pour sa réponse à la protéine virale Tat, qui active fortement élongation de la transcription du génome virale, et par conséquence joue un rôle crucial dans la latence. La région du promoteur de base responsable pour la trans-activation par Tat est nommée TASHET pour TATA box and Adjacent Sequences of HIV Essential for Tat trans-activation. Après avoir utilisé l’ADN TASHET comme matrice pour la chromatographie d’affinité, il a été possible d’identifier par spectrométrie de masse des protéines cellulaires qui se sont liées à TASHET et permettent la trans-activation par Tat, incluant un nouveau complexe HDAC. Nos résultats suggèrent que ce complexe HDAC est recruté au promoteur VIH via sa sous-unité PICH-37. Les protéines PICH représentent donc de nouvelles cibles thérapeutiques vers l’éradication du VIH.

Objectif: En dépit du traitement, le VIH persiste notamment dans les organes immunoprivilégiés comme le testicule, où les réponses immunitaires sont réduites. Notre objectif est de caractériser les populations myéloïdes suppressives du testicule pour évaluer leur implication dans la persistance du VIH.

Méthodes: Les testicules de 16 adultes non infectés ont été collectés après chirurgie de réassignation sexuelle. La fréquence des macrophages immunosuppresseurs, des DCs myéloïdes (mDCs) et plasmacytoïdes (pDCs) a été évaluée par cytométrie de flux après digestion enzymatique du tissu. Les niveaux d’enzyme immunosuppressive IDO ont été quantifiés par RT-qPCR.

Résultats: Les suspensions de cellules testiculaires contiennent 9% de leucocytes. Les cellules myéloïdes (lin^- HLA-DR⁺) testiculaires représentent 30% des leucocytes et montrent une forte expression de HLA-DR comparé à leurs homologues du sang périphérique (p=0.004). Les macrophages suppresseurs (lin^- HLA-DR⁺ CD14⁺ CD163⁺) représentent 20% des leucocytes. La majorité des DCs testiculaires (lin^- CD14^- HLA-DR⁺) sont des mDCs (CD11c⁺) contrastant avec de rares pDCs (CD123⁺). La quantité d’ARNm d’IDO est remarquablement plus importante dans les testicules que dans les PBMCs.

Conclusion: Pour la première fois chez l’homme, ces résultats démontrent l’existence d’un environnement immunoprivilégié du testicule médié par les cellules myéloïdes, propice à la persistance du VIH.

En dépit de traitements antirétroviraux, le VIH persiste ce qui conduit à un rebond de la virémie à l’arrêt du traitement. Notre travail a été d’analyser les cellules réservoirs au sein des organes lymphoïdes, afin de mieux comprendre les mécanismes d’échappement au traitement. Nous avons infecté 9 macaques Rhésus par le SIV dont 7 ont été traités pendant 7 semaines par une thérapie antivirale administrée au 4^ème jour d’infection. Les animaux traités ont été euthanasiés aux jours 11, 14, 28 et 35, puis aux jours 10, 15 et 18 après arrêt du traitement. Les 2 contrôles ont été sacrifiés aux jours 33 et 60. Le sang, la rate, les ganglions axillaires/inguinaux/mésentériques ont été prélevés. Les sous-populations T CD4 (naïves, mémoires et Tfh) ont été séparées à l’aide d’un trieur de cellules. L’ADN et l’ARN viral ont été quantifiés dans chacune des sous-populations lymphocytaires ainsi que la charge virale plasmatique par qPCR. La capacité de ces cellules à produire de nouveaux virus infectieux a été réalisée après activation à l’aide d’un cocktail d’anticorps anti-CD3/anti-CD28. Le virus dans le surnageant a été quantifié. Nos résultats préliminaires montrent que les sous-populations TCM, Tfh et TDT de la rate et des ganglions mésentériques constituent des réservoirs viraux.  

Ce travail a été soutenu par les IRSC (Réseau canadien sur le VIH, CanCURE). JE remercie le programme de Chaire de recherche du Canada pour l'aide financière.

L'interaction entre les CE et Th17 est essentielles pour le maintien de l'homéostasie immunitaire au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 produisent des cytokines qui vont interagir avec les CE pour favoriser la production de CCL20/MIP-3α, un peptide chimiotactique pour les cellules CCR6 ⁺ Th17. Nous avons étudié l'impact du VIH-1 sur l'interaction entre les CE et Th17 ainsi que la trans infection du VIH dans un environnement riche en CCL20.Les CE intestinales (HT-29) ont été stimulées par le TNF-α et/ou IL-17A en présence ou l'absence des  souches du VIH. Les lymphocytes T CD4 + mémoires ont été isolées. La trans infection des cellules T par des CE a été étudiée dans des expériences de coculture entre CE exposés au VIH et les lymphocytes T activés. Les niveaux des chimiokines CCL20 ont été quantifiés dans les surnageants de culture cellulaire par ELISA. L'expression intracellulaire de la protéine p24 du VIH dans les cellules T ont été mesurées par FACS.L’IL-17A réagit uniquement en synergie avec le TNF-α pour amplifier la production de CCL20 et l'exposition au VIH augmente la production de CCL20 par les CE en réponse à IL-17A et TNF-α. La trans infection du  VIH dans des cocultures de CE et des cellules T se fait de façon plus robuste en présence de niveaux élevés de CCL20 produites par CE stimulées par l’IL-17A et le TNF-α.Nous démontrons que la transmission du VIH par les CE aux cellules T est proportionnelle à l'amplitude de la production de CCL20.

Il est généralement admis que l’étude de la rémission à long terme de l’infection à VIH chez l’enfant contribue nombre d’éléments conceptuels originaux et d’opportunités de découverte à l’entreprise de recherche sur la guérison du VIH-sida. L’objectif central de l’étude EPIC⁴ (« Early Pediatric Initiation, Canada Child Cure Cohort Study ») était de déterminer si l’initiation précoce de traitement antirétroviral combiné chez des enfants ayant contracté une infection à VIH par la voie mère-enfant pouvait mener à une guérison fonctionnelle. Au moyen d’approches technologiques de pointe, l’étude avait également pour but d’examiner chez ces enfants a) la taille du réservoir viral du VIH dans différents sous-types cellulaires; b) les marqueurs d’activation immunitaire, d’inflammation tissulaire, de dysfonction endothéliale, et de translocation microbienne; et c) la genèse et le développement des réponses immunitaires VIH-spécifiques. Plus de 215 nouveau-nés, enfants et adolescents infectés par le VIH provenant de 9 sites à travers le Canada ont été recrutés dans l’étude EPIC4 depuis 2015. Une base de données cliniques exhaustive (EPIC⁴ REDCap Database) et une banque de spécimens (EPIC⁴ Biobank) ont été mises sur pieds, ainsi que plusieurs partenariats stratégiques et activités de transfert de connaissances. L’objectif de cette présentation est de mettre à jour l’avancement de l’étude EPIC⁴ et d’offrir un survol des résultats des analyses biomédicales effectuées jusqu’à ce jour. 

Si au cours du siècle dernier de nombreux vaccins ont été élaborés avec succès vis-à-vis de nombreux microbes, avec la découverte du virus de l’immunodéficience humaine, la communauté scientifique est confrontée à de nouveaux défis. Qu’est-ce qu’un bon vaccin, et pour ceux qui existent quel est le corrélat de protection? Par quels mécanismes éradiquer un virus “caché” au plus profond de nos tissus, et éliminer les cellules porteuses de ce virus ? Les récentes données des thérapies antirétrovirales démontrent en effet l’existence de tels sanctuaires, potentiellement actifs, tel un volcan que l’on croirait éteint. Par conséquent, si les anticorps permettent d’endiguer le virus libre comment éliminer les cellules infectées au sein de ces tissus, en particulier chez les personnes infectées. Les modèles de primates non-humains contribuent à mieux appréhender ces mécanismes, et à redéfinir nos stratégies d’intervention. À travers le consortium pancanadien sur le Sida, CanCURE, nos objectifs sont d’établir cette cartographie des sanctuaires tissulaires et cellulaires sous traitement. De mieux comprendre la pénétrance des  traitements au sein de ces tissus, et d’identifier les cellules susceptibles de jouer un rôle important dans la genèse d’anticorps, mais aussi dans celles capables d’éliminer les cellules infectées.