208 - ACPHAGES : applications et caractérisation des phages

Il est reconnu que les phages sont les entités biologiques les plus abondantes de la planète. Ce sont des virus qui infectent et détruisent spécifiquement des bactéries. On les retrouve aux mêmes endroits que les bactéries et ils jouent un rôle prépondérant dans le maintien de l’équilibre des écosystèmes. En fait, les phages sont d’excellents modèles viraux applicables à une panoplie de domaines. Les bactériophages peuvent être à la fois nos amis et nos ennemis. Amis puisqu’ils suppriment des populations bactériennes aux propriétés nocives, incluant des bactéries pathogènes. Des phages peuvent aussi avoir des applications industrielles et médicales comme agents de biocontrôle. Ennemis puisqu’ils détruisent des bactéries qui jouent un rôle important dans les fermentations, particulièrement dans l’industrie agroalimentaire. Ce colloque présentera des travaux récents sur les diverses applications des phages en santé, en agriculture et en environnement ainsi que sur la caractérisation de ces virus à l'aide de nouveaux outils de recherche.

La collection de bactéries, virus, champignons et autres microorganismes présents dans les intestins humains, regroupés sous le terme de microbiote intestinal, est essentielle pour notre développement et santé. La plupart des études réalisées jusqu’à présent se sont concentrées sur les rôles majeurs des bactéries intestinales pour notre digestion, la mise en place et le fonctionnement de notre système immunitaire, le métabolisme des médicaments, et leurs rôles dans les maladies inflammatoires intestinales. Les virus intestinaux, principalement des bactériophages, ont été peu étudiés, malgré leur abondance. Des études récentes ont montré que les bactériophages peuvent moduler les communautés bactériennes intestinales et soulignent ainsi leur potentiel thérapeutique. Durant cette présentation, je parlerai de nos projets explorant le rôle des bactériophages dans le contexte de maladies inflammatoires intestinales. Je mettrai aussi en évidence le fait que tous les phages n’agissent pas de la même façon et que certains phages ont tout intérêt à maintenir une interaction stable avec leurs hôtes bactériens.

Les phages tempérés sont capables de choisir entre un cycle lytique ou lysogénique (dormant). Ces phages sont responsables de plus de 10²⁴ infections par seconde, et la majorité des bactéries contiennent déjà dans leurs génomes au moins un phage dormant, attendant le bon signal pour se réveiller et lyser son hôte. La décision entre la lyse et la lysogénie est possiblement la plus importante de toute la biologie. Nous investiguons comment biaiser cette décision afin de contrôler le comportement des phages. En utilisant le phage modèle HK97, nous avons démontré que les antibiotiques qui induisent dans la bactérie la réparation SOS, ce qui induit les phages tempérés, produisent une synergie convertissant un phage tempéré en un bactéricide extrêmement efficace. Curieusement, plusieurs antibiotiques qui n’interagissent pas avec la réparation SOS – notamment des inhibiteurs de la traduction génétique - peuvent aussi donner ce même effet. Ceci n’est pas le résultat d’une induction du phage, mais du fait que l’antibiotique empêche l’entrée à la lysogénie, ce qui résulte en un comportement strictement lytique. Profitant de ces deux voies biaisant le comportement des phages, nous effectuons des criblages ciblés et à haut débit afin de découvrir d’autres composés chimiques capables de manipuler cette décision.

Les souches d'Escherichia coli adhérentes invasives (AIEC) sont fréquemment isolées de selles de patients atteints de dysbiose intestinale. Ces souches ont des propriétés remarquables d'adhérence à l'épithélium intestinal et survivent dans les macrophages. La souche AIEC LF82 a été isolée d’un patient atteint de la maladie de Crohn. Elle contient cinq prophages complets et nous avons entrepris leur analyse, à la fois in vitro et à l'intérieur des macrophages. Nous avons démontré qu’ils forment tous des virions. Le prophage Gally est de loin le plus actif, générant spontanément plus de 10⁸ virions par mL dans des surnageants de culture in vitro, >100 fois plus que les autres prophages. Gally est induit encore 10 fois plus après un stress génotoxique généré par la ciprofloxacine. Cependant, l’infection de macrophages par la souche LF82, dont on sait qu’elle provoque une réponse SOS, ne provoque pas la comportement attendu pour Gally : au lieu d’être augmentée, la production de virions Gally est diminuée de +20 fois par rapport à in vitro. De plus, le profil de transcription des gènes du prophage indique qu'une partie du module de structure est spécifiquement réprimée tandis que le module de réplication est surexprimé par rapport aux conditions de culture non stressées. Nous concluons que la souche LF82 a développé un moyen efficace pour "apprivoiser" son prophage le plus actif lorsqu’elle envahit un macrophage, ce qui peut participer à sa survie dans les macrophages.

L'industrie de la volaille est un secteur économique important pour le Canada et est en constante augmentation depuis 10 ans. Malheureusement, ce secteur est aussi un grand consommateur d'antibiotiques. C'est la raison pour laquelle l'Union européenne a banni en 2006 l'utilisation des antibiotiques comme stimulateurs de croissance chez les animaux d'élevage. Bien que ce bannissement ait permis de diminuer la pression de sélection sur les souches résistantes, l’effet dit facteur de croissance a été perdu par les éleveurs qui ont également constaté une hausse des maladies infectieuses. Les bactériophages, virus infectant spécifiquement les bactéries, jouent un rôle déterminant dans la régulation de divers écosystèmes microbiens, incluant la microflore intestinale. Dans la présente étude, nous avons commencé à explorer les relations entre les bactériophages et les bactéries présents dans la microflore de poulets nourris avec différentes alternatives aux antibiotiques. Nous avons été en mesure d’identifier que la microflore intestinale est modulée par certains compléments alimentaires et que les performances de croissance des oiseaux sont également impactées.

Les virus sont l'entité biologique dominante de l'océan. Ils jouent un rôle vital dans les cycles biogéochimiques et fournissent à leurs hôtes de nouvelles capacités grâce à l’échange de gènes métaboliques auxiliaires (AMG). Harvey, un ouragan de catégorie 4 qui a touché terre sur la côte du Texas en 2017, a frappé la région de Houston avec 1,4-1,7 x 1010 m3 de précipitations. Dans ce projet, nous visions à caractériser comment les changements de conditions abiotiques apportés par Harvey ont modifié les assemblages viraux de la Baie de Galveston au niveau taxonomique et à déterminer comment les fonctions de l'écosystème viral ont été modifiées. Les métagénomes des virus et des communautés microbiennes ont été séquencés lors d’échantillonages d’un transect dans la baie de Galveston au cours des cinq semaines suivant Havey. Nos résultats montrent que les assemblages viraux de la baie de Galveston ont radicalement changé après le passage de Harvey. Parmi les paramètres abiotiques mesurés, la salinité a eu le plus fort effet sur la composition des assemblages viraux. Au cours des cinq semaines qui ont suivi Harvey, il y a eu une augmentation constante des gènes métaboliques. Notre étude fournit le premier aperçu approfondi de la façon dont les assemblages viraux marins réagissent à des événements de précipitations extrêmes qui, selon plusieurs modèles climatiques, vont devenir de plus en plus fréquents et intenses.

L’efficacité de capture réelle des masques de protection en ce qui concerne les bioaérosols est méconnue. Ces efficacités sont déterminées en laboratoire à l’aide de poussières et de particules de tailles standardisées. Cette étude a pour objectifs d’évaluer et comparer la capacité de filtration des virus et des particules des masques de protection à l’aide d’un tunnel à vent et de comparer l’efficacité de capture des aérosols viraux de masques de protection. Un tunnel de vent a été conçu et construit afin de nébuliser des bactériophages et mesurer les aérosols viraux en amont et en aval de matériau filtrant (masques de protection). Des aérosols sont générés à partir d’une solution tampon chargée des phages MS2 et ΦX174. Des échantillonneurs d’air et des compteurs de particules sont placées en amont et en aval du masque afin de mesurer ce qui est retenu par celui-ci. Les échantillons collectés par les échantillonneurs d’air sont utilisés pour quantifier par culture (virus infectieux) et par qPCR (génomes totaux) les virus présents dans l’air en amont et en aval du masque. L’efficacité de capture est déterminée en comparant les quantités et la distribution granulométrique des aérosols en amont et en aval ainsi que les virus totaux et infectieux. Aucune différence significative n’a été observée entre la capacité de rétention des aérosols viraux et particulaires. Des travaux sont en cours afin d’étudier l’impact de la taille des aérosols sur l’efficacité de capture des virus.

CRISPR-Cas est un système immunitaire adaptatif bactérien qui prévient l’infection par les bactériophages. Pour développer une immunité, les bactéries ajoutent dans leur locus CRISPR des fragments d’ADN viraux. Cette stratégie est risquée puisqu’elle nécessite l’exposition des bactéries à de l’ADN de phage infectieux afin d’acquérir l’information nécessaire. Cependant, l’obtention de l’information génétique à partir d’une source alternative permettrait d’établir l’immunité CRISPR sans risque. L’utilisation de la compétence, la capacité des bactéries d’intégrer de l’ADN libre, représente une opportunité d’accès à l’information nécessaire et élimine le risque d’infection. Nous avons observé que S. thermophilus exploite l’ADN libre afin de développer une immunité contre le phage 2972. Le nombre de bactéries développant une immunité augmente avec la quantité d’ADN de phage dans l’environnement et diminue lors son élimination. De plus, l’ajout d’ADN d’un phage apparenté favorise l’acquisition d’espaceurs correspondant à la région commune aux deux phages. Nous suggérons que S. thermophilus acquiert de l’ADN de l’environnement afin de préparer son système immunitaire à une future infection. Ces résultats font un lien entre la compétence naturelle et le système CRISPR-cas et pourraient mener à une meilleure compréhension de l’émergence de l’immunité CRISPR-Cas, mais aussi à de nouvelles techniques de manipulation génétique mettant à profit la compétence naturelle des bactéries.

Les systèmes CRISPR-Cas sont des systèmes de défense présents dans les génomes de près de la moitié des bactéries séquencées. Ils permettent aux bactéries de se défendre contre du matériel génétique étranger, comme des phages et des plasmides, grâce à un mécanisme de reconnaissance et de coupure. Les espaceurs, de courtes séquences présentes dans le locus CRISPR, sont identiques à des régions du matériel génétique de l’envahisseur. Lors d’une infection, les espaceurs guident les protéines Cas vers ces sites pour effectuer une coupure, permettant ultimement de bloquer l’infection. Le degré d’activité des systèmes CRISPR-Cas est variable d’une bactérie à l’autre et selon l’environnement. Pour Escherichia coli, le système est inactif en conditions de laboratoire. Le but de ce projet était de caractériser la diversité des régions CRISPR dans des isolats d’E. coli obtenus d’échantillons fécaux, d’investiguer si le système est actif dans cet écosystème et d’identifier les cibles des espaceurs. À la suite de l’amplification et du séquençage du locus CRISPR de 1769 isolats provenant de 639 enfants, 60% des isolats étaient positifs pour un locus CRISPR. En comparant le contenu en espaceurs, nous avons regroupé ces isolats en 36 types CRISPR différents. Les recherches d’homologie ont montré que les espaceurs ne ciblent pas spécifiquement des phages intestinaux. Nous avons identifié des séquences homologues pour 60% des espaceurs et déterminé que la grande majorité cible des prophages.

Les phages représentent l’entité biologique la plus abondante de la planète. Le première étape critique du cycle d’infection des phages est leur adsorption à un récepteur à la surface cellulaire. Toutefois, l’adsorption des phages n’aboutit pas toujours à l’infection des cellules, un phénomène dû à des mécanismes de défenses cellulaires. Ceci est peu étudié puisque les essais classiques d’adsorption virale nécessitent beaucoup de ressources et les résultats obtenus sont souvent variables et ambigus. C’est pourquoi ce projet vise l’emploi de la fluorescence comme technique alternative aux essais classique d’adsorption virale.

Comme preuve de concept, nous avons utilisé différents phages et souches de Lactococcus lactis, une bactérie lactique utilisée pour la fabrication de fromages. La microscopie à fluorescence s’est avérée efficace pour distinguer visuellement l’adsorption ou la non-adsorption de trois phages de L. lactis, dont les résultats ont été confirmés par des essais d’adsorption classiques. Ainsi, les phages et les cellules bactériennes ont été marqués avec des molécules fluorescentes différentes, puis l’observation de la position des différents signaux permet de déterminer s’il y a adsorption des phages. Afin de quantifier cette dernière, ce projet implique maintenant le développement d’une méthode à semi haut-débit utilisant un lecteur de plaque à fluorescence pour mesurer l’adsorption d’un phage sur un grand nombre de souches bactériennes en un seul essai

La bactérie pathogène Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida (A. sal.) est l’agent étiologique de la furonculose chez les salmonidés d’élevage. Au Québec, les éclosions de furonculose sont traitées par antibiotiques, mais plusieurs souches sont résistantes, voire multirésistantes à tous les antibiotiques disponibles. Pour élaborer un traitement alternatif aux antibiotiques pour le secteur piscicole, nous avons étudié in vitro l'inhibition d'A. sal. par cinq phages isolés dans des piscicultures québécoises ou provenant de la collection Félix d’Hérelle. Ces phages, individuel ou en cocktail de deux à cinq phages, ont révélé un potentiel thérapeutique croissant selon le nombre de phages dans le cocktail. Une combinaison de quatre phages s'est avérée la plus efficace lorsqu'elle est utilisée à un multiple d’infection de 1 contre A. sal. 01-B526. Le même cocktail de phages est efficace contre d'autres souches d’A. sal. à l’exception de celles porteuses du Prophage 3, qui est présent dans les 2/3 des souches de la province. Pour confirmer l'impact de ce prophage, nous avons testé l'efficacité du cocktail sur des souches parentales vierges ou lysogénisées avec le Prophage 3. Les résultats indiquent que la présence du Prophage 3 dans le génome d'A. sal. peut affecter l'efficacité d'un cocktail de phages virulents à des fins de phagothérapie. Afin de contourner cette problématique, l’isolement de nouveaux phages sensibles à des souches d’A. sal. porteuses du Prophage 3 est en cours.

La bactérie Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida est responsable de la furonculose, une infection causant des pertes économiques majeures dans les piscicultures. Il y a un intérêt pour la phagothérapie et la découverte de nouveaux phages pour contrôler cette maladie. Dans cette étude, nous avons isolé le phage tempéré LPM4 d’un poisson infecté. Ce phage est la forme virulente du Prophage 3, un prophage présent dans le chromosome de plusieurs souches d’A. salmonicida ssp. salmonicida provenant de l’Amérique du Nord. LPM4 a une morphologie typique des phages de la famille des Myoviridae. Ce phage infecte spécifiquement des souches d’A. salmonicida ssp. salmonicida qui ne possèdent pas déjà le Prophage 3 dans leur génome. En utilisant des souches mutantes et complémentées, nous avons aussi démontré que LPM4 nécessite la présence d’une « A-layer » à la surface des bactéries lors de l’infection, suggérant que cette couche protéique pourrait être le récepteur du phage. Nous avons également produit des souches lysogènes possédant le Prophage 3 (c.-à-d. LPM4) avec des souches sensibles portant divers éléments génétiques, comme différents type d’AsaGEIs (îlots génomiques). Cette étude a permis de mettre en évidence de nouvelles facettes du Prophage 3, incluant l’existence d’une forme virulente de ce prophage. LPM4 sera également un outil précieux pour des études futures sur la relation entre A. salmonicida ssp. salmonicida et les phages.

Clostridioides difficile (CD) est la cause principale de diarrhée post-antibiotique dans les pays industrialisés. Les traitements standards utilisés pour traiter la bactérie s’avèrent inefficaces pour empêcher les récidives. C’est pourquoi d’autres alternatives thérapeutiques sont envisagées, comme la phagothérapie, qui consiste à utiliser les bactériophages (phages), i.e. des virus ciblant spécifiquement les bactéries. L’objectif de cette étude est de caractériser la spécificité d’interaction des phages envers leur bactérie hôte. CD possède à sa surface une enveloppe protéique, la « couche S », majoritairement composée de la protéine SlpA. Une souche mutante n’exprimant pas SlpA à sa surface a été isolée, et s’est avérée être résistante à tous les phages capables d’infecter la souche sauvage normalement. Des tests de complémentation et d’infection de la souche mutante exprimant différentes isoformes de SlpA ont montré que les phages sont capables de reconnaître spécifiquement une ou plusieurs isoformes de la protéine afin d’infecter la bactérie. De plus, une partie du domaine variable de faible poids moléculaire de SlpA semble être déterminante pour l’adsorption et l’infection par certains phages. Nos travaux permettront éventuellement l’élaboration de cocktails de phages thérapeutiques ciblant différentes isoformes de SlpA et permettant de couvrir l’ensemble des souches de CD responsables d’infections.

L’énumération de bactériophages par plages de lyse est une étape critique dans divers protocoles. Aujourd’hui, la référence pour obtenir ces abondances est un comptage manuel, ce qui est long, sujet à des erreurs humaines, et limité à des boîtes de Petri avec un nombre de plages de lyse comptables.
Nous présentons OnePetri, une application pour téléphone intelligent open-source utilisant une collection de modèles d’apprentissage automatique (« machine learning ») entraînés pour l’énumération rapide de plages de lyse de bactériophages sur des boîtes de Petri. Nos modèles d’apprentissage automatique ont été formés avec des photos d’expériences de plages de lyse menées par des étudiants dans le programme de découverte de bactériophages SEA-PHAGES, du Howard Hughes Medical Institute. Un total de 137 et 4 875 objects de reference ont été utilisé pour la formation des modèles de détection des boîtes de Petri et plages de lyse, respectivement, tous les deux ayant avec une haute précision et rappel.
Comparé au protocole de référence (comptage manuel), OnePetri est ~30x plus rapide. Comparé à d’autres outils analytiques similaires, OnePetri avait un taux d’erreur relatif (~13%) inférieur que l’outil « Plaque Size Tool » (PST; ~86%) et « CFU.AI » (~19%), tout en ayant également réduit considérablement les temps de détection comparé à PST (~2x plus rapide).

L’étude du comportement des virus dans l’air et du développement d’approches de mitigation a pris toute son importance en situation pandémique. Depuis plusieurs années, la recherche sur l’aérovirologie fait appel aux bactériophages comme précieux modèles de virus eucaryotes. Les phages MS2, phiX174, PR772 et Phi6 sont des outils qui ont aidé à comprendre l’impact des méthodes d’échantillonnage sur l’intégrité des virus, développer des méthodes de quantification efficaces ou à étudier l’impact de l’ozone et d’autres méthodes de mitigation des aérosols viraux dans des essais en laboratoire et à échelle réelle. Des modèles de phages sont présentement appliqués afin de mieux caractériser l’efficacité des masques en contexte pandémique. Finalement, la métagénomique virale a aussi permis de valider l’importance de certains phages comme marqueurs universels de la contamination aérienne virale des fermes porcines. Cette présentation offrira un survol de différentes études ayant mis à profit les bactériophages dans un contexte de bioaérosols.

La contamination des aliments par des bactéries pathogènes est la cause de millions de maladies et de décès à chaque année dans le monde. Les procédures de surveillance de la qualité alimentaire et de détection d’agents pathogènes microbiens sont au cœur de l’amélioration de notre sécurité alimentaire. De nouvelles approches complémentaires aux pratiques courantes sont donc requises pour éviter des cas graves d’intoxications alimentaires et des rappels coûteux.

Les phages ont la capacité particulière de reconnaître leur hôte bactérien de façon très spécifique. Cette caractéristique peut être exploitée pour développer des technologies de détection de bactéries pathogènes plus rapides et plus sensibles. Notre groupe de recherche combine la modification des propriétés de bactériophages par le génie génétique avec l’ingénierie des matériaux pour développer de telles applications. Nous démontrerons comment l’expression de protéines permettant la mesure de signaux spécifiques par des phages bioconjugués à des structures de polymères dégradables permet une amélioration de la détection de bactéries pathogènes. Les matériaux développés peuvent donc être utilisés pour la surveillance en continu d’aliments et de sources d’eau potable de même que le dépistage d’infections bactériennes.

Clostridioides difficile est une bactérie pathogène opportuniste parmi les plus problématiques en milieu hospitalier depuis plusieurs années. Cette bactérie profite d’une dysbiose de la microflore intestinale engendrée par la prise d’antibiotiques pour établir une infection menant à une colite parfois sévère et même fatale. Les traitements actuels sont basés sur l’administration d’antibiotiques, mais les taux de récurrence sont élevés et la prise d’antibiotiques ne fait souvent qu’exacerber la dysbiose intestinale à l’origine même de l’infection. La phagothérapie représente une approche alternative explorée depuis plusieurs années qui pourrait permettre de cibler spécifiquement C. difficile, tout en épargnant les bactéries bénéfiques de l’intestin. Or, les phages capables d’infecter C. difficile disponibles actuellement ne sont pas adaptés pour la phagothérapie. Toutefois, les récentes percées dans le domaine de l’ingénierie génétique des phages et une meilleure compréhension du spectre d’hôte des phages de C. difficile laissent entrevoir de nouvelles perspectives. Les principaux défis liés au développement de la phagothérapie des infections à C. difficile et les récentes avancées dans l’étude des interactions phages-C. difficile seront présentés au cours cette conférence.

La bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida est responsable d'infections importantes en aquaculture. Il s'agit d'un des enjeux les plus importants nuisant à la prospérité économique des piscicultures faisant l’élevage de salmonidés au Québec. Beaucoup de souches de cette bactérie présentent des résistances multiples aux antibiotiques limitant voire empêchant complètement le traitement des infections causées par A. salmonicida subsp. salmonicida. Afin de développer une approche thérapeutique alternative aux antibiotiques, nous avons exploré au cours des dernières années la possibilité d’utiliser la phagothérapie pour combattre les infections provoquées par cette bactérie. En s'appuyant sur une approche combinant la génomique et les travaux en laboratoire sur plusieurs centaines de souches bactériennes et une demi-douzaine de phages, dont certains isolés pendant cette étude, il a été possible de mettre au jour des interactions complexes entre cette bactérie et les différents phages pouvant l’infecter, les prophages présents dans son génome ainsi que des îlots génomiques dérivés d'anciens virus. La présentation fera le tour de différents éléments qui ont été découverts et qui permette d'envisager une utilisation prometteuse de la phagothérapie contre A. salmonicida subsp. salmonicida.

De l’idée aux premières ventes, le chemin peut être long et laborieux. Nous avons mis au point un produit composé de cinq bactériophages efficaces contre la majorité des souches causant la colibacillose chez le poulet de chair en quelques mois. Quelle est la meilleure façon d’administrer le produit : sur les œufs, dans l’eau, dans la nourriture ou l’utiliser comme décontaminant de l’environnement de production ? Plusieurs facteurs sont à considérer pour prendre la bonne décision, mais la réalité de l’industrie et l’adoption du produit par les éleveurs sont parmi les plus importants. Un produit un peu moins efficace, mais plus facile d’utilisation sera préférable à un produit plus efficace mais qui restera sur les tablettes. Nous vous présentons l’évolution de notre produit à travers la réalité industrielle et réglementaire.