208 - ACPHAGES : applications et caractérisation des phages

L’efficacité de capture réelle des masques de protection en ce qui concerne les bioaérosols est méconnue. Ces efficacités sont déterminées en laboratoire à l’aide de poussières et de particules de tailles standardisées. Cette étude a pour objectifs d’évaluer et comparer la capacité de filtration des virus et des particules des masques de protection à l’aide d’un tunnel à vent et de comparer l’efficacité de capture des aérosols viraux de masques de protection. Un tunnel de vent a été conçu et construit afin de nébuliser des bactériophages et mesurer les aérosols viraux en amont et en aval de matériau filtrant (masques de protection). Des aérosols sont générés à partir d’une solution tampon chargée des phages MS2 et ΦX174. Des échantillonneurs d’air et des compteurs de particules sont placées en amont et en aval du masque afin de mesurer ce qui est retenu par celui-ci. Les échantillons collectés par les échantillonneurs d’air sont utilisés pour quantifier par culture (virus infectieux) et par qPCR (génomes totaux) les virus présents dans l’air en amont et en aval du masque. L’efficacité de capture est déterminée en comparant les quantités et la distribution granulométrique des aérosols en amont et en aval ainsi que les virus totaux et infectieux. Aucune différence significative n’a été observée entre la capacité de rétention des aérosols viraux et particulaires. Des travaux sont en cours afin d’étudier l’impact de la taille des aérosols sur l’efficacité de capture des virus. 

CRISPR-Cas est un système immunitaire adaptatif bactérien qui prévient l’infection par les bactériophages. Pour développer une immunité, les bactéries ajoutent dans leur locus CRISPR des fragments d’ADN viraux. Cette stratégie est risquée puisqu’elle nécessite l’exposition des bactéries à de l’ADN de phage infectieux afin d’acquérir l’information nécessaire. Cependant, l’obtention de l’information génétique à partir d’une source alternative permettrait d’établir l’immunité CRISPR sans risque. L’utilisation de la compétence, la capacité des bactéries d’intégrer de l’ADN libre, représente une opportunité d’accès à l’information nécessaire et élimine le risque d’infection. Nous avons observé que S. thermophilus exploite l’ADN libre afin de développer une immunité contre le phage 2972. Le nombre de bactéries développant une immunité augmente avec la quantité d’ADN de phage dans l’environnement et diminue lors son élimination. De plus, l’ajout d’ADN d’un phage apparenté favorise l’acquisition d’espaceurs correspondant à la région commune aux deux phages. Nous suggérons que S. thermophilus acquiert de l’ADN de l’environnement afin de préparer son système immunitaire à une future infection. Ces résultats font un lien entre la compétence naturelle et le système CRISPR-cas et pourraient mener à une meilleure compréhension de l’émergence de l’immunité CRISPR-Cas, mais aussi à de nouvelles techniques de manipulation génétique mettant à profit la compétence naturelle des bactéries. 

Les systèmes CRISPR-Cas sont des systèmes de défense présents dans les génomes de près de la moitié des bactéries séquencées. Ils permettent aux bactéries de se défendre contre du matériel génétique étranger, comme des phages et des plasmides, grâce à un mécanisme de reconnaissance et de coupure. Les espaceurs, de courtes séquences présentes dans le locus CRISPR, sont identiques à des régions du matériel génétique de l’envahisseur. Lors d’une infection, les espaceurs guident les protéines Cas vers ces sites pour effectuer une coupure, permettant ultimement de bloquer l’infection. Le degré d’activité des systèmes CRISPR-Cas est variable d’une bactérie à l’autre et selon l’environnement. Pour Escherichia coli, le système est inactif en conditions de laboratoire. Le but de ce projet était de caractériser la diversité des régions CRISPR dans des isolats d’E. coli obtenus d’échantillons fécaux, d’investiguer si le système est actif dans cet écosystème et d’identifier les cibles des espaceurs. À la suite de l’amplification et du séquençage du locus CRISPR de 1769 isolats provenant de 639 enfants, 60% des isolats étaient positifs pour un locus CRISPR. En comparant le contenu en espaceurs, nous avons regroupé ces isolats en 36 types CRISPR différents. Les recherches d’homologie ont montré que les espaceurs ne ciblent pas spécifiquement des phages intestinaux. Nous avons identifié des séquences homologues pour 60% des espaceurs et déterminé que la grande majorité cible des prophages.

Les phages représentent l’entité biologique la plus abondante de la planète. Le première étape critique du cycle d’infection des phages est leur adsorption à un récepteur à la surface cellulaire. Toutefois, l’adsorption des phages n’aboutit pas toujours à l’infection des cellules, un phénomène dû à des mécanismes de défenses cellulaires. Ceci est peu étudié puisque les essais classiques d’adsorption virale nécessitent beaucoup de ressources et les résultats obtenus sont souvent variables et ambigus. C’est pourquoi ce projet vise l’emploi de la fluorescence comme technique alternative aux essais classique d’adsorption virale.

Comme preuve de concept, nous avons utilisé différents phages et souches de Lactococcus lactis, une bactérie lactique utilisée pour la fabrication de fromages. La microscopie à fluorescence s’est avérée efficace pour distinguer visuellement l’adsorption ou la non-adsorption de trois phages de L. lactis, dont les résultats ont été confirmés par des essais d’adsorption classiques. Ainsi, les phages et les cellules bactériennes ont été marqués avec des molécules fluorescentes différentes, puis l’observation de la position des différents signaux permet de déterminer s’il y a adsorption des phages. Afin de quantifier cette dernière, ce projet implique maintenant le développement d’une méthode à semi haut-débit utilisant un lecteur de plaque à fluorescence pour mesurer l’adsorption d’un phage sur un grand nombre de souches bactériennes en un seul essai

La bactérie pathogène Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida (A. sal.) est l’agent étiologique de la furonculose chez les salmonidés d’élevage. Au Québec, les éclosions de furonculose sont traitées par antibiotiques, mais plusieurs souches sont résistantes, voire multirésistantes à tous les antibiotiques disponibles. Pour élaborer un traitement alternatif aux antibiotiques pour le secteur piscicole, nous avons étudié in vitro l'inhibition d'A. sal. par cinq phages isolés dans des piscicultures québécoises ou provenant de la collection Félix d’Hérelle. Ces phages, individuel ou en cocktail de deux à cinq phages, ont révélé un potentiel thérapeutique croissant selon le nombre de phages dans le cocktail. Une combinaison de quatre phages s'est avérée la plus efficace lorsqu'elle est utilisée à un multiple d’infection de 1 contre A. sal. 01-B526. Le même cocktail de phages est efficace contre d'autres souches d’A. sal. à l’exception de celles porteuses du Prophage 3, qui est présent dans les 2/3 des souches de la province. Pour confirmer l'impact de ce prophage, nous avons testé l'efficacité du cocktail sur des souches parentales vierges ou lysogénisées avec le Prophage 3. Les résultats indiquent que la présence du Prophage 3 dans le génome d'A. sal. peut affecter l'efficacité d'un cocktail de phages virulents à des fins de phagothérapie. Afin de contourner cette problématique, l’isolement de nouveaux phages sensibles à des souches d’A. sal. porteuses du Prophage 3 est en cours. 

La bactérie Aeromonas salmonicida ssp. salmonicida est responsable de la furonculose, une infection causant des pertes économiques majeures dans les piscicultures. Il y a un intérêt pour la phagothérapie et la découverte de nouveaux phages pour contrôler cette maladie. Dans cette étude, nous avons isolé le phage tempéré LPM4 d’un poisson infecté. Ce phage est la forme virulente du Prophage 3, un prophage présent dans le chromosome de plusieurs souches d’A. salmonicida ssp. salmonicida provenant de l’Amérique du Nord. LPM4 a une morphologie typique des phages de la famille des Myoviridae. Ce phage infecte spécifiquement des souches d’A. salmonicida ssp. salmonicida qui ne possèdent pas déjà le Prophage 3 dans leur génome. En utilisant des souches mutantes et complémentées, nous avons aussi démontré que LPM4 nécessite la présence d’une « A-layer » à la surface des bactéries lors de l’infection, suggérant que cette couche protéique pourrait être le récepteur du phage. Nous avons également produit des souches lysogènes possédant le Prophage 3 (c.-à-d. LPM4) avec des souches sensibles portant divers éléments génétiques, comme différents type d’AsaGEIs (îlots génomiques). Cette étude a permis de mettre en évidence de nouvelles facettes du Prophage 3, incluant l’existence d’une forme virulente de ce prophage. LPM4 sera également un outil précieux pour des études futures sur la relation entre A. salmonicida ssp. salmonicida et les phages. 

Clostridioides difficile (CD) est la cause principale de diarrhée post-antibiotique dans les pays industrialisés. Les traitements standards utilisés pour traiter la bactérie s’avèrent inefficaces pour empêcher les récidives. C’est pourquoi d’autres alternatives thérapeutiques sont envisagées, comme la phagothérapie, qui consiste à utiliser les bactériophages (phages), i.e. des virus ciblant spécifiquement les bactéries. L’objectif de cette étude est de caractériser la spécificité d’interaction des phages envers leur bactérie hôte. CD possède à sa surface une enveloppe protéique, la « couche S », majoritairement composée de la protéine SlpA. Une souche mutante n’exprimant pas SlpA à sa surface a été isolée, et s’est avérée être résistante à tous les phages capables d’infecter la souche sauvage normalement. Des tests de complémentation et d’infection de la souche mutante exprimant différentes isoformes de SlpA ont montré que les phages sont capables de reconnaître spécifiquement une ou plusieurs isoformes de la protéine afin d’infecter la bactérie. De plus, une partie du domaine variable de faible poids moléculaire de SlpA semble être déterminante pour l’adsorption et l’infection par certains phages. Nos travaux permettront éventuellement l’élaboration de cocktails de phages thérapeutiques ciblant différentes isoformes de SlpA et permettant de couvrir l’ensemble des souches de CD responsables d’infections.

L’énumération de bactériophages par plages de lyse est une étape critique dans divers protocoles. Aujourd’hui, la référence pour obtenir ces abondances est un comptage manuel, ce qui est long, sujet à des erreurs humaines, et limité à des boîtes de Petri avec un nombre de plages de lyse comptables. 
Nous présentons OnePetri, une application pour téléphone intelligent open-source utilisant une collection de modèles d’apprentissage automatique (« machine learning ») entraînés pour l’énumération rapide de plages de lyse de bactériophages sur des boîtes de Petri. Nos modèles d’apprentissage automatique ont été formés avec des photos d’expériences de plages de lyse menées par des étudiants dans le programme de découverte de bactériophages SEA-PHAGES, du Howard Hughes Medical Institute. Un total de 137 et 4 875 objects de reference ont été utilisé pour la formation des modèles de détection des boîtes de Petri et plages de lyse, respectivement, tous les deux ayant avec une haute précision et rappel. 
Comparé au protocole de référence (comptage manuel), OnePetri est ~30x plus rapide. Comparé à d’autres outils analytiques similaires, OnePetri avait un taux d’erreur relatif (~13%) inférieur que l’outil « Plaque Size Tool » (PST; ~86%) et « CFU.AI » (~19%), tout en ayant également réduit considérablement les temps de détection comparé à PST (~2x plus rapide). 

L’étude du comportement des virus dans l’air et du développement d’approches de mitigation a pris toute son importance en situation pandémique. Depuis plusieurs années, la recherche sur l’aérovirologie fait appel aux bactériophages comme précieux modèles de virus eucaryotes. Les phages MS2, phiX174, PR772 et Phi6 sont des outils qui ont aidé à comprendre l’impact des méthodes d’échantillonnage sur l’intégrité des virus, développer des méthodes de quantification efficaces ou à étudier l’impact de l’ozone et d’autres méthodes de mitigation des aérosols viraux dans des essais en laboratoire et à échelle réelle. Des modèles de phages sont présentement appliqués afin de mieux caractériser l’efficacité des masques en contexte pandémique. Finalement, la métagénomique virale a aussi permis de valider l’importance de certains phages comme marqueurs universels de la contamination aérienne virale des fermes porcines. Cette présentation offrira un survol de différentes études ayant mis à profit les bactériophages dans un contexte de bioaérosols.

La contamination des aliments par des bactéries pathogènes est la cause de millions de maladies et de décès à chaque année dans le monde. Les procédures de surveillance de la qualité alimentaire et de détection d’agents pathogènes microbiens sont au cœur de l’amélioration de notre sécurité alimentaire. De nouvelles approches complémentaires aux pratiques courantes sont donc requises pour éviter des cas graves d’intoxications alimentaires et des rappels coûteux.

Les phages ont la capacité particulière de reconnaître leur hôte bactérien de façon très spécifique. Cette caractéristique peut être exploitée pour développer des technologies de détection de bactéries pathogènes plus rapides et plus sensibles. Notre groupe de recherche combine la modification des propriétés de bactériophages par le génie génétique avec l’ingénierie des matériaux pour développer de telles applications. Nous démontrerons comment l’expression de protéines permettant la mesure de signaux spécifiques par des phages bioconjugués à des structures de polymères dégradables permet une amélioration de la détection de bactéries pathogènes. Les matériaux développés peuvent donc être utilisés pour la surveillance en continu d’aliments et de sources d’eau potable de même que le dépistage d’infections bactériennes.

Clostridioides difficile est une bactérie pathogène opportuniste parmi les plus problématiques en milieu hospitalier depuis plusieurs années. Cette bactérie profite d’une dysbiose de la microflore intestinale engendrée par la prise d’antibiotiques pour établir une infection menant à une colite parfois sévère et même fatale. Les traitements actuels sont basés sur l’administration d’antibiotiques, mais les taux de récurrence sont élevés et la prise d’antibiotiques ne fait souvent qu’exacerber la dysbiose intestinale à l’origine même de l’infection. La phagothérapie représente une approche alternative explorée depuis plusieurs années qui pourrait permettre de cibler spécifiquement C. difficile, tout en épargnant les bactéries bénéfiques de l’intestin. Or, les phages capables d’infecter C. difficile disponibles actuellement ne sont pas adaptés pour la phagothérapie. Toutefois, les récentes percées dans le domaine de l’ingénierie génétique des phages et une meilleure compréhension du spectre d’hôte des phages de C. difficile laissent entrevoir de nouvelles perspectives. Les principaux défis liés au développement de la phagothérapie des infections à C. difficile et les récentes avancées dans l’étude des interactions phages-C. difficile seront présentés au cours cette conférence. 

La bactérie Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida est responsable d'infections importantes en aquaculture. Il s'agit d'un des enjeux les plus importants nuisant à la prospérité économique des piscicultures faisant l’élevage de salmonidés au Québec. Beaucoup de souches de cette bactérie présentent des résistances multiples aux antibiotiques limitant voire empêchant complètement le traitement des infections causées par A. salmonicida subsp. salmonicida. Afin de développer une approche thérapeutique alternative aux antibiotiques, nous avons exploré au cours des dernières années la possibilité d’utiliser la phagothérapie pour combattre les infections provoquées par cette bactérie. En s'appuyant sur une approche combinant la génomique et les travaux en laboratoire sur plusieurs centaines de souches bactériennes et une demi-douzaine de phages, dont certains isolés pendant cette étude, il a été possible de mettre au jour des interactions complexes entre cette bactérie et les différents phages pouvant l’infecter, les prophages présents dans son génome ainsi que des îlots génomiques dérivés d'anciens virus. La présentation fera le tour de différents éléments qui ont été découverts et qui permette d'envisager une utilisation prometteuse de la phagothérapie contre A. salmonicida subsp. salmonicida.

De l’idée aux premières ventes, le chemin peut être long et laborieux. Nous avons mis au point un produit composé de cinq bactériophages efficaces contre la majorité des souches causant la colibacillose chez le poulet de chair en quelques mois. Quelle est la meilleure façon d’administrer le produit : sur les œufs, dans l’eau, dans la nourriture ou l’utiliser comme décontaminant de l’environnement de production ? Plusieurs facteurs sont à considérer pour prendre la bonne décision, mais la réalité de l’industrie et l’adoption du produit par les éleveurs sont parmi les plus importants. Un produit un peu moins efficace, mais plus facile d’utilisation sera préférable à un produit plus efficace mais qui restera sur les tablettes. Nous vous présentons l’évolution de notre produit à travers la réalité industrielle et réglementaire.