104 - Séquençage à haut débit et bioinformatique : besoins, enjeux et défis en pays en voie de développement

L’épidémie à virus d’Ebola de 2014-2016 en Afrique de l’Ouest fut la première épidémie durant laquelle, le séquençage à haut débit (SHD) local fut utilisé à grande échelle. Les séquences virales obtenues furent cruciales pour l’identification de chaines de transmission atypiques, pour lesquelles aucun lien épidémiologique n’était disponible.

À la vue de l’apport du SHD durant la gestion de cette épidémie, nous avons décidé d’intégrer le SHD dans nos réponses contre les fièvres hémorragiques ainsi que dans nos activités de surveillance des pathogènes à fort potentiel épidémique en Afrique. Durant l’épidémie à virus d’Ebola de 2017 en République Démocratique du Congo, nous avons séquencé le virus d’Ebola obtenu d’individus infectés. Nous essayons également de séquencer le virus d’Ebola à partir de l’ARN de chauve-souris infectées. En plus de nos activités de surveillance et de diagnostic, nous avons mis au point une formation sur le SHD pour les chercheurs d’Afrique Centrale et de l’Ouest. Cette présentation résumera nos activités de diagnostiques, de surveillance virale et de formation liées au SHD.

Introduction: Le monkeypox (variole du singe) est une maladie infectieuse causée par le virus monkeypox, du genre Orthopoxvirus et de la famille des Poxviridae. Les principaux signes cliniques de monkeypox chez l'homme sont des lésions maculopapulaires qui apparaissent initialement sur le visage, la paume des mains, plante des pieds et dans la plupart des cas, se propage rapidement de manière centrifuge sur tout le corps.

Aspects cliniques: De décembre 2015 à janvier 2016, 10 cas de monkeypox ont été identifiés et signalés dans la sous-préfecture de Bangassou à l’est de la RCA. Les deux premiers cas cliniques sont survenus chez des enfants de 5 et 9 ans d’une famille de chasseurs. Le cas index, un garçon de 9 ans, a développé une éruption après avoir tué et découpé un rongeur connu localement sous le nom de "cibissi" et identifié comme Thryonomis. Il s’en est suivi une épidémie avec modes de transmission : familial, liés transports et aux soins de santé.

Résultats: La présence du virus monkeypox a été mise en évidence par la technique de PCR à partir du sang et de pus chez 3 patients, tandis que le virus a été détecté chez les trois patients plus un 4ème à partir de prélèvements de croûtes après inoculation sur cerveau de souriceaux nouveau-nés. La caractérisation de la souche a montré qu’elle appartient au génotype de virus circulant dans le bassin du Congo.

Conclusion: Nous rapportons pour la première fois la preuve formelle de la transmission interhumaine du monkeypox.

Introduction: Le cancer du col utérin est le plus fréquent et le plus létal chez la femme d’Afrique Sub-Saharienne. Les Virus du Papillome Humain (VPH)_ notamment 16 et 18_ en sont la cause majeure. Dans les lésions cervicales de haut-grade, le VPH est souvent intégré au génome des cellules – hôtes. Ici, nous explorons l’intégration du VPH chez des patientes gabonaises suspectées de lésions cervicales testées positives pour les types 16 et 18.

Méthodologie: 35 échantillons de frottis en milieu liquide ont été analysés. Les ADN en ont été extraits et ont servi à la préparation de banques d’ADN destinées à un séquençage à haut débit (SHD), enrichies en séquences viral par double-capture. Les données générées ont permis d’évaluer l’intégration virale.  

Résultats: L’intégration varie selon le grade cytologique ; 85.7% pour les carcinomes, les HSIL 71.4%, les ASCH 66.7%, les LSIL 60% et les ASCUS 30.8%. Dans les haut-grades cytologiques (carcinomes et HSIL) les VPH 16 et 18 représentent 92% des formes intégrées ; le 16 y est retrouvé à 71.4%. Des génotypes minoritaires (33, 51, 58, 59) ont été détectés dans des LSIL,  excepté le 59 qui a été identifié dans un HSIL. 10 génotypes (30, 35, 39, 44, 45, 53, 56, 59, 74, 82) ont uniquement été retrouvés sous forme épisomale.

Conclusion: Le niveau d’intégration du VPH semble varier avec le grade. Agrandir la cohorte d’étude permettrait d’évaluer son potentiel clinique comme biomarqueur moléculaire de la progression des lésions cervicales.

Contexte: La peste des petits ruminants (PPR) et la dermatose nodulaire contagieuse sont des maladies virales endémiques aiguës de petits ruminants d'importance économique.

Objectif: Déterminer la prévalence de la co-infection entre les deux virus en République Démocratique du Congo, caractériser le virus de la dermatose nodulaire contagieuse en se basant sur le séquençage des gènes P32, RPO30, GPCR et établir la relation phylogénétique entre son gène P32 et celui de la protéine de fusion (F) du génome du virus de la PPR.  

Méthodologie: Des échantillons des tissus, d’écouvillons et du sang total ont été prélevés chez des chèvres asymptomatiques et symptomatiques de ces deux maladies au Sud Kivu, Est de la RD Congo. La réaction de polymerisation en chaine (PCR) en une seule étape et la transcriptase inverse en deux étapes (RT-PCR) ont été utilisées pour amplifier les gènes cibles. Les échantillons positifs ont été séquencés pour l'analyse phylogénétique.  

Résultats et Conclusion: Sur 150 animaux testés, 64,7% étaient positifs au PPR, 52,7% à la dermatose nodulaire contagieuse et 38,7% pour les deux. La comparaison par paires des nucléotides du gène P32 et du gène F a montré 99,75% de pourcentage d'identité au sein des séquences du virus de la dermatose nodulaire contagieuse, 96,95% pour le virus de PPR et 47,91% entre les séquences de ces deux virus. L’infection mixte de ces deux maladies est prévalente en RD Congo.  

L’objectif de cette étude était de déterminer les séquences des gènes qui codent pour le cytochrome C oxydase et montrer comment on peut les utiliser pour identifier les animaux. Les méthodologies utilisées étaient les techniques de biologie moléculaire basées sur le code barre ADN. Les résultats obtenus indiquent que les espèces exploitées comme viande de brousse ont été identifiées. Le Cephalophus dorsalis présente une sous unités Cytochrome C Oxydase mitochondrien issu de la séquence 1 un nombre égal  de 608 et rangée de 129 à 608. Elle a une longueur de 655pb et un degré de similarité de 92%,  avec 1% de gaps. Le Cephalophus callipygus présente une sous unités Cytochrome C Oxydase mitochondrien issu des séquences 2  un nombre égal  de 658 et rangée de 12 à 672. Elle a une longueur de 663pb et un degré de similarité de 98%,  avec 0% de gaps. Ces outils ont un impact positif sur la gestion de la faune avec la description soit de nouvelles espèces ou bien de clarification d’espèces connues, soit la traçabilité des animaux. Les séquences d’ADN des animaux et leurs sous unités Cytochrome C Oxydase sont des informations complémentaires contribuant à l’identification des animaux. De ces résultats, nous pouvons déduire que les techniques de biologie moléculaire sont un outil de traçabilité de la faune sauvage.  

Introduction : La variole du singe est une zoonose causée par le virus du monkeypox (MPXV). La plupart des cas humains d’infection à MPXV recensés sont survenus en Afrique centrale, principalement République démocratique du Congo (RDC). Cependant des cas ont également été signalés en Afrique de l'Ouest et aux États-Unis pour la première fois en 2003. Ici nous avons séquencé et caractérisé sept souches différentes de MPXV provenant de cas individuels et de petits foyers épidémiques en République Centrafricaine (RCA).

Méthodes : Des banques d'ADN ont été préparées à partir d’échantillons biologiques puis enrichies en séquences MPXV par capture. Ces dernières ont été séquencées à l’aide de la plateforme Illumina (MiSeq) du CIRMF – GABON. Les lectures pairées obtenues ont été nettoyées et filtrées selon la qualité et la taille. Les génomes entiers MPXV ont été obtenus après mapping sur le génome de référence de RDC. Les prédictions de protéines ont été faites par FraGeneScan et leur identification a été confirmée par BLASTX. Un alignement multiple des polymorphismes ou Indels identifiés pour chaque souche a aussi été fait.

Conclusions: Nos analyses indiquent que les 7 génomes séquencés sont distincts. Cela suggère qu’entre 2001 et 2015, différentes souches issues de divers réservoirs animaux ont circulé en RCA. Des analyses plus approfondies pourraient permettre l’identification de potentiels motifs propres au réservoir animal, encore méconnu, dont les MPXV proviennent.

Les nouvelles technologies de séquençage permettent d’explorer de nouveaux écosystèmes naturels, mais l’analyse de ces grands jeux de données complexes nécessite l’optimisation des pipelines bioinformatiques.  

Dans les grottes d’Afrique centrale, les chauves-souris coexistent avec de nombreux insectes impliqués dans le cycle naturel des arbovirus et des hématozoaires. L’objectif de notre étude est d’identifier la nature et les fonctions actives des communautés microbiennes portées par ces insectes, en milieu cavernicole éloigné de l’activité humaine. Nous avons développé un pipeline pour l’étude du catalogue des ARNs oumétatranscriptomes des moustiques. Conçu pour être utilisé en local, il inclut une méthode de réduction exacte et une étape de soustraction in silico pour réduire la taille des échantillons. Il inclut des outils d’identification des ARNr 16S, 18S, 23S et 28S et des outils d’annotation fonctionnelle des ARNm. Sa performance a été évaluée sur 3 réplicats techniques et 18 jeux de paramètres tests. Comparé à une application web existante, ce pipeline montre une très bonne efficacité en temps d’analyse, une facilité d’accès aux paramètres, une bonne reproductibilité et précision d’analyse, et une meilleure lisibilité des résultats.  

L’analyse d’un premier jeu de donnés révèle l’expression des gènes de microorganismes environnementaux et aussi de bactéries, virus et parasites, responsables de maladies infectieuses endémiques dans la région.  

Introduction: L'émergence de virus pathogènes en Afrique ces dernières années place la découverte de pathogènes comme un domaine prioritaire pour l’ensemble du continent. Aujourd’hui le diagnostic moléculaire inclut la détection du virus de même que son identification et sa caractérisation. Lors d’épidémies, l’efficacité de réponse dépend de la rapidité d’identification du pathogène en cause. Avoir in situ de toute la logistique requise pour le traitement d’échantillons constitue un atout majeur.

Contexte: Les méthodes usuelles de diagnostic moléculaire limitent le champ d’investigation à des cibles connues qui rend le diagnostic de cas négatifs fastidieux. Le séquençage à haut débit (SHD) offre les outils nécessaires à une caractérisation plus complète des pathogènes détectés et une exploration moléculaire approfondie, sans à priori, des cas d’étiologie inconnue. En Afrique, l’accès au SHD est rendu possible par l’export d’acides nucléiques à des fins d'analyses en externe. Outre le risque biologique et la perte de temps associés, il en résulte la fuite de biomatériel exploitable qui amoindrit les possibilités de recherches locales.

Objectifs: Pour mieux répondre aux besoins en santé et en recherche au Gabon, le CIRMF s’est muni d’une plateforme SHD qui offre une autonomie précieuse pour le diagnostic et la surveillance épidémiologique des maladies infectieuses. Nous présenterons ce plateau technique et des exemples pratiques de son utilisation en diagnostic et en recherche.