116 - Recherche VIH/SIDA : données scientifiques qui apportent un éclairage nouveau

Les lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 jouent un rôle majeur dans l'immunité des muqueuses contre les pathogènes. La déplétion des Th17 intestinales chez les sujets infectés par le VIH-1 mène à la translocation microbienne, qui est une cause d'activation immunitaire chronique et de progression vers le stade SIDA. La haute permissivité des Th17 à l'infection explique en partie leur déplétion. Les cellules T naïves se différencient en Th17 après engagement du TCR en présence de cytokines spécifiques. Nous démontrons que la différenciation Th17 des cellules T naïves est altérée de façon significative chez les sujets VIH+, incluant les sujets avec restauration du compte CD4 et contrôle de la charge virale sous thérapie antirétrovirale (ART). Ce déficit de polarisation Th17 est associé à une fréquence diminuée des précurseurs Th17 à phénotype CD25+CD127-FoxP3+ au sein des cellules T naïves. La fréquence des précurseurs Th17 est corrélée positivement avec le compte CD4 et avec la fréquence des cellules Th17 mémoires; à l'opposé, on observe une corrélation négative avec l'âge dans la population VIH- contrôle. Ainsi, le déclin des précurseurs Th17 reflète un processus de vieillissement prématuré chez les sujets VIH+ qui n'est pas réversible sous ART. Nos résultats apportent la première évidence que le déficit Th17 chez les sujets VIH+ coïncide avec la rareté des précurseurs Th17. Les mécanismes de déplétion des précurseurs Th17 sont présentement explorés au laboratoire et seront discutés.

Introduction: Deux génotypes encodant pour des récepteurs de cellules NK sont associés à la protection contre l'infection par le VIHCeux-ci favorisent le développement de cellules NK qui suppriment  la réplication du VIH par les cellules CD4 autologues infectées, et ce plus efficacement qu'un génotype contrôle (non-protecteur) tel que  le Bw6 hmz.   

 Hypothèse: Les cellules NK activées sécrètent les chimiokines CCL3, 4 et 5, qui bloquent l'entrée du VIH dans leurs cellules cibles CD4+ grâce au fait qu'elles se lient au co-récepteur CCR5. Le génotype KIR/HLA influence le niveau de CC-chimiokines sécrétées.

 Méthode: Nous avons utilisé un sytème de co-culture de cellules NK et CD4 autologues VIH+ pour évaluer le niveau de CC-chimiokines dans les surnageants de ces cultures et le niveau de p24 suite à l'ajout d'anticorps neutralisants pour CCL3, 4 et 5.

 Résultats et conclusion: Les NK sécrètent davantage  des 3 CC-chimiokineslorsqu'elles proviennent de sujets ayant des génotypes protecteurs. L'inhibition de la réplication du VIH dans les cellules CD4 autologues infectées par les cellules NK est partiellement inversée par l'ajout, au début de la culture, d'anticorps neutralisants pour les 3 CC-chimiokines. La sécrétion des CC-chimiokines est un mécanisme par lequel les cellules NK activées suppriment la réplication du VIH. Les génotypes KIR/HLA influencent le niveau de chimiokines sécrétées par les cellules NK, donc ce phénomène pourrait contribuer à la protection.



Que ce soit lors de l'inflammation ou dans des conditions homéostatiques, les chemiokines possèdent des rôles spécialisés afin de maintenir la balance immunitaire. Le récepteur CCR7 et ses ligands naturels, CCL19 et CCL21, contrôlent finement la réponse immunitaire, en permettant, entre autres, la migration des cellules vers les organes lymphoïdes secondaires. Notre laboratoire a récemment démontré que les monocytes expriment CCR7 et migrent en réponse à leurs ligands naturel, CCL19 et CCL21.

Les monocytes jouent des rôles clefs dans le contrôle des processus immunologiques. Bien que les réservoirs majeurs du VIH-1 soient les cellules T, des données suggèrent que les monocytes représentent une source sous estimée de virus. Nos travaux visent à caractériser les effets des prostaglandines, molécules lipidiques dictant le caractère et l'ampleur de la réponse inflammatoire, sur l'expression de CCR7 et son impact sur la migration des monocytes exposés au VIH-1. Nos résultats démontrent que l'expression de CCR7 est diminuée en présence du VIH-1, suggérant que le virus évite ainsi la présentation antigénique dans les ganglions lymphatiques. Par contre, la présence du PGE₂ favorise une mobilité accrue des monocytes exposées en réponse aux ligands naturels de CCR7. Actuellement, nos efforts visent à utiliser le potentiel de migration des monocytes CCR7+ pour délivrer des nano-antirétroviraux aux sites réservoirs du VIH-1 ouvrant la voie à de nouveaux outils thérapeutiques.



L'interférence ARN (iARN) est un mécanisme par lequel des petits ARNs double-brins (micro/miARNs) se fixent sur des ARNs messagers (ARNm) pour réguler leur expression. L'iARN utilise un complexe protéique formé par les protéines Dicer, TRBP et Ago2, puis les corps-P cytoplasmiques. Les miARNs d'une cellule influencent la réplication virale tandis que les virus modifient l'expression ou l'activité des miARNs. Dans des cellules exprimant le VIH et chez des patients infectés, des miARNs et des ARNm sont exprimés différemment que chez les non infectés, ce qui suggère une modification de l'expression et de la spécificité des miARNs. Nous avons observé que le mécanisme d'iARN reste fonctionnel dans des cellules infectées par le VIH, ce qui implique un changement de spécificité des miARNs plutôt qu'un dérèglement massif. Un ARN structuré du VIH, le RRE, agit comme suppresseur d'iARN sans modifier les protéines du complexe d'iARN. Par contre, l'ARN RRE déplace des petits ARNs interférants de la protéine TRBP ce qui suggère un changement de l'incorporation des miARNs dans le complexe d'iARN. Nous avons aussi noté que l'expression de la protéine ADAR1, une adénosine déaminase agissant sur l'ARN, est augmentée pendant la réplication du VIH. ADAR1 induit des mutations A vers I, puis I est reconnu comme G, ce qui modifie la spécificité des miARNs cellulaires. Ces changements d'incorporation et de spécificité vont déréguler l'expression des ARNm cellulaires et donc le fonctionnement de la cellule.



Les exosomes sont des microvésicules d'origine endosomale qui facilitent la communication intercellulaire. D'une part, leur voie de dissémination converge avec celle de la capture et du transfert des particules du virus d'immunodéficience humaine (VIH-1) dans les cellules dendritiques. D'autre part, ces vésicules libérées dans les tissus à la suite d'une activation cellulaire, et notamment par le VIH-1, peuvent aussi se retrouver dans la circulation sanguine et refléter ainsi l'activation locale.  Les particules virales et les exosomes partageant des propriétés similaires telles que la taille et leur contenu protéique, lipidique et en acides nucléiques,  il est donc difficile de les distinguer. Afin de les identifier et les purifier, nous avons adapté des méthodes au laboratoire qui nous ont permis de caractériser les microvésicules et/ou les exosomes issus de cellules dendritiques ou des lymphocytes en contact avec le VIH-1, ou encore des exosomes provenant du plasma de patient VIH-1.  Nous avons ensuite vérifié leurs impacts sur la survie cellulaire dans le but de déterminer les liens avec la pathogenèse. L'ensemble de ces recherches apporte des indices supplémentaires dans la compréhension du rôle des exosomes dans la pathogenèse de l'infection à VIH-1.



Nous avons cultivé du VIH-1 de différents sous-types dans des cellules mononucléaires du sang périphérique en présence de concentrations croissantes de DTG.  Après six mois, nous avons atteint une concentration qui ne permet plus au virus de se développer.  Le génome viral a été séquencé et les mutations ont été caractérisées. Les mutations R263K ou G118R suivies de la mutation H51Y dans l'intégrase sont les mutations de résistance les plus fréquentes chez les sous-types B et C.  La mutation R263K confère une résistance au DTG de 2 à 5 fois et diminue de 30% l'activité de transfert de brin de l'intégrase recombinante purifiée et la réplication virale.  La mutation H51Y n'a pas d'effet sur l'activité enzymatique ou la résistance au DTG mais la combinaison H51Y/R263K augmente la résistance au DTG à 12 fois et diminue la réplication virale de 70%, l'activité de transfert de brin et l'intégration dans l'ADN cellulaire. Pendant plus d'un an de sélection aucune mutation compensatoire additionnelle n'a été détectée. Ces résultats contredisent la situation habituelle dans laquelle les mutations secondaires augmentent les niveaux de résistance aux médicament et simultanément restaurent la réplication virale ainsi que la fonction enzymatique, et permettent d'expliquer pourquoi la résistance primaire au DTG n'apparait pas dans les études cliniques.  La validation de ces découvertes dans un modèle animal pourrait encourager l'utilisation du DTG dans des stratégies d'éradication.



Le SIDA représente une des pandémies majeures de ces trente dernières années. Alors que l'épidémie sévie dans les années 80, et que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) responsable du Sida est identifié en 1983, la découverte d'une atteinte pathologique similaire chez les macaques rhésus a été cruciale à l'étude de cette maladie (Letvin NL, Proc Natl Acad Sci USA, 1983). Ainsi, ce modèle a permis d'établir dès les années 80 le rôle du virus dans la survenue de cette pathologie et d'identifier les tissus cibles du virus. L'analyse des différentes espèces de primates non humains a permis rétrospectivement d'identifier les origines de cette infection. Ainsi, plus d'une trentaine d'espèce de singes vivant en Afrique est infectée par un virus simien. Ce modèle expérimental a été également essentiel dans le développement de vaccins ou de thérapies anti-rétrovirales. Ainsi, la dernière génération d'inhibiteur à savoir l'inhibiteur de l'intégrase du VIH a été validée in vivo chez le singe avant d'être testé chez les personnes infectées par le VIH. Aujourd'hui, nos travaux portent sur l'identification des facteurs d'hôtes qui en relation avec la mort cellulaire programmée participe au déficit immunitaire et à la survenue du SIDA. Une meilleure compréhension de ces mécanismes devrait nous permettre de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques et d'améliorer les réponses vaccinales.



Plusieurs molécules proinflammatoires sont produites par les cellules neurologiques lorsqu'il y a infection par le VIH-1. Parmi celles-ci, nous retrouvons les eicosanoides tels que les leucotriènes (LTs) qui sont souvent présentes dans le liquide cérébrospinal d'individus infectés. À ce jour, le rôle que peut jouer ces médiateurs lipidiques inflammatoires dans la pathogénèse du VIH-1 est toujours méconnu. Nous nous sommes donc intéressés à mieux comprendre comment les LTs peuvent affecter l'infection du système nerveux central par le VIH-1. Nos données suggèrent que les LTs inhibent non seulement l'entrée virale, mais aussi les étapes précoces de l'infection qui suivent la fusion membranaire du VIH-1 dans les microglies. En effet, lorsque ces cellules sont traitées avec des LTs, on observe une diminution significative du niveau d'ADN proviral dans les cellules microgliales résultant d'un blocage d'étapes de la réplication virale après l'importation nucléaire de façon protéine kinase C (PKC)-dépendante.  Nous avons aussi étudié l'effet des LTs sur les astrocytes et nous avons pu mettre en évidence la capacité des astrocytes stimulés par le leucotriène C4 (LTC4) à induire la transmigration de lymphocytes T CD4+ infectées par le VIH-1 au travers d'un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique. Nos résultats démontrent aussi l'implication de la chimiokine CX3CL1 dans ce processus. Nos travaux permettent de faire la lumière sur le rôle des LTs dans la neuropathogénèse du VIH-1.

L'existence d'une protéine du VIH-1 traduite à partir d'un transcrit antisens a été suggéré en 1988. Le but de notre étude était de détecter cette protéine nommée ASP (AntiSense Protein) dans des cellules de mammifères et de déterminer une fonction potentielle. Pour ce faire, nous avons optimisé les codons de la séquence d'ASP. Nous avons ainsi réussi à détecter ASP par Western Blot pour la première fois dans les COS7 et 293T. Nous avons aussi démontré qu'ASP était rapidement dégradée. Suite à des analyses de localisation suggérant un profil ponctué ressemblant à des autophagosomes, un lien entre l'autophagie et ASP a été approfondi par des analyses de WB dirigées contre des marqueurs de l'autophagie (LC3-II et Beclin-1). De plus, l'inhibition de l'autophagie par le 3-MA démontrait une augmentation significative du nombre de cellules positives pour ASP. À l'aide d'un vecteur d'expression GFP-LC3, nous avons aussi clairement démontré une co-localisation et une interaction entre ASP et LC3-II. Plus important, après traitement au 3-MA, ASP a été détectée par WB suite à la transfection de l'ADN proviral du VIH-1.

Cette étude démontre ainsi que le transcrit antisens du VIH-1 est traduit en une protéine dans les cellules de mammifères et que l'induction de l'autophagie  peut expliquer la difficulté à la détecter et justifier sa très faible abondance dans les cellules infectées. Une possible implication d'ASP dans l'induction de l'autophagie doit être approfondie.



BST2/Tetherin est un facteur de restriction induit par l'interféron qui inhibe fortement la relâche du VIH-1 en agissant comme une ancre sur les particules virales en voie de bourgeonnement à la surface des cellules infectées. Le VIH-1 contrecarre l'effet antiviral de BST2 à travers la protéine accessoire Vpu. En effet, Vpu réduit les niveaux de BST2 à la membrane plasmique en séquestrant le facteur de restriction dans le réseau trans Golgien et en induisant sa dégradation dans les lysosomes par un processus dépendant du recrutement de la E3 ubiquitine ligase SCF^βTrCP. À part son activité antivirale, BST2 a été identifié comme le ligand du récepteur inhibiteur, ILT7, retrouvé spécifiquement à la surface des dendritiques plasmacytoïdes (CDP). L'engagement de BST2 avec ILT7 active une voie de signalisation qui conduit à l'inhibition de la production d'interféron de type 1 (IFN-1) TLR7/TLR9-dépendant dans les CDP activées.  Ainsi, nos résultats récents démontrent que Vpu réduit la production d'IFN-1 lors de la détection du VIH-1 par les CDP par un mécanisme qui implique son effet antagoniste vis-à-vis BST2. Dans le contexte de cette présentation, nous démontrerons comment à travers une régulation très fine des niveaux de BST2 à la surface des cellules infectées, Vpu augmente la relâche du VIH-1 et interfère avec la réponse antivirale des CDP.  Ces résultats apportent un éclairage nouveau sur les mécanismes moléculaires et cellulaires régissant la transmission et la persistance du VIH-1.



L'infection au VIH-1 représente un problème d'importance pour la santé humaine. Malgré le fait que plus de 30 médicaments antiviraux sont utilisés présentement, les infections au VIH-1 demeurent élevées et une résistance aux médicaments se développe. Le potentiel pathogénique du VIH-1 provient de son habileté surprenante à contrecarrer la réponse antivirale. Le VIH-1 recrute les composantes majeures de la cellule hôte à ses fins. Par exemple, la cellule hôte séquestre un grand nombre de composantes cellulaires importantes pour générer des granules de stresse (GS), une réponse innée afin de prévenir la propagation du virus. Notre groupe a démontré que le VIH-1 s'oppose de façon spécifique à cette réponse innée cellulaire en interagissant avec la protéine cellulaire eEF2 qui cause un blocage accru de la formation de GS. Nous avons aussi découvert un mécanisme par lequel le virus assure sa survie dans des conditions de croissance cellulaires sous-optimales. En effet, le VIH-1 maintient l'activité enzymatique du complexe protéique mTOR, critique pour la régulation de la voie de synthèse protéique et la croissance cellulaire. Nous allons élaborer sur ces nouvelles contre-mesures élaborées par le VIH-1 pour assurer sa survie en prévenant tout délai dans la synthèse de ses protéines virales. En résumé, la manipulation de nombreuses protéines cellulaires et les changements imposés à la cellule par le VIH-1 démontrent pourquoi il est impératif de développer de nouvelles thérapies antivirales.

Les interférons (IFN) ont des propriétés antivirales et sont impliqués dans la modulation de la réponse immunitaire. Le facteur de transcription IRF7 occupe un rôle central dans le développement de cette réponse, en favorisant l'expression des IFN de type 1. Nous avons déjà démontré qu'une infection avec le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) augmente l'expression d'IRF7 dans les macrophages. Dans le cadre de ce projet, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le VIH-1 vient troubler l'équilibre entre les protéines IRF3 et IRF7, modifiant ainsi le patron des gènes exprimés. Nous avons utilisé l'approche de l'immuniprécipitation de la chromatine suivie d'un séquençage à haut débit (ChIP-Seq) à partir d'ADN de macrophages infecté ou non par le VIH-1. Les résultats de ChIP-Seq démontrent que IRF3 et IRF7 modulent des ensembles de gènes distincts (78 gènes en communs et plus de 300 gènes uniques) dans les macrophages lors d'une infection par le VIH-1, incluant des gènes impliqués dans le sentier signalitique des IFN. De plus, le profil des gènes régulés par IRF7 varie grandement en présence du VIH-1 et le nombre de gènes modulés est près de 5 fois inférieur. Parmis les candidats les plus intéressants, on retrouve des protéines liées à NFkB, dont MAP3K1 qui peut contribuer à la réplication du VIH. Nos résultats supportent donc l'hypothèse que le VIH-1 pourrait utiliser la protéine IRF7 pour déjouer la réponse immunitaire innée lors d'une infection.