Voyage organisé pour engrais biologiques

« Cette image témoigne d'une expérience aboutie. Les bactéries (en vert) ont réussi à manger leur vaisseau. Elles sont prêtes à s'attaquer aux phytopathogènes. Mais cette image, n'est qu'une parmi plusieurs quand il s'agit de valider une preuve scientifique sous l'optique du microscope »

Je suis microscopiste de profession. Une sorte d’inspecteur faisant la preuve par l’image des hypothèses de recherche. Le dossier dont je vais vous entretenir ici concerne la construction d’un vaisseau très spécial. L’intention est de fabriquer un véhicule transportant les spores d’un agent biologique dont la mission est de lutter contre certaines maladies des végétaux. Le vaisseau doit assurer la conservation, le transport et la dispersion dans le milieu. Une fois dans les champs, il doit aussi faciliter la reproduction et la colonisation de l’agent en devenant « nourriture ». 

L'agent de lutte « bio »

Cet agent biologique est « plusieurs ». Ce sont des bactéries appelées streptomycètes que l'on retrouve tout simplement dans le sol. Plusieurs souches ont été isolées, caractérisées puis identifiées comme des « antagonistes » des phytopathogènes par l’équipe de la professeure Carole Beaulieu. De fait, une de ces souches, Streptomyces melanosporofaciens  EF-76, inhibe la croissance de la plupart des champignons et bactéries à Gram positif. C’est la principale « bête » utilisée pour cette étude.

Bactérie qui dort...

Nous avons choisi d’utiliser la spore plutôt que la cellule bactérienne.  La spore est petite, condensée et opaque. De plus, elle résiste mieux que la cellule aux agents chimiques et physiques,et peut donc survivre dans des conditions très défavorables. C’est aussi un état de dormance. Et comme pour la Belle au bois dormant, ce sommeil peut s’éterniser. De fait, on a retrouvé des spores bactériennes dans les pyramides égyptiennes, et il a été possible de les cultiver.

Étape 1 : Caractérisation des spores

Le travail du microscopiste consiste dans un premier temps à caractériser ces spores. La FIGURE 1 présente un résumé de cette étape de travail.

• A : Colonie de Streptomyces melanosporofaciens; les spores se trouvent dans la zone blanche.
• B : Coupe transversale de la colonie
• C : Coupe transversale montrant une région de jeunes bactéries filamenteuses
• D : Début de la formation des spores (petits points bleus) dans les colonies plus âgées
• E : Coupe d’un culot de spores purifiées, confirmant la qualité de la préparation
• F : Image d’un examen des spores in situ en contraste de phase
• G : Spores au sommet de la colonie, vues en microscopie électronique à balayage (MEB)
• H : Grossissement permettant de visualiser l'ultrastructure (échelle de structure faisant référence, règle générale, aux parties internes d’une cellule)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Étape 2 : Viabilité des spores

Nous avons donc obtenu des spores, et nous les avons purifiées. Mais sont-elles encore viables? Lorsque l’on regarde en microscopie électronique par transmission (MET) une coupe de 50 nm d’épaisseur de la bactérie, on voit très bien que cette dernière est filamenteuse (FIGURE 2A). La spore, quant à elle, est plutôt sphérique au même grossissement  (FIGURE 2B). Cependant, ces images ne nous renseignent pas sur la viabilité des spores, mais plutôt sur leur morphologie et leur ultrastructure.

Pour cette seconde partie de l’enquête, nous avons utilisé une coloration nommée LIVE/DEAD ®, qui teinte en rouge les spores mortes et en vert les spores vivantes. La FIGURE 2C montre le résultat : la majorité des spores sont vivantes. Nos passagers sont prêts, passons maintenant à la fabrication du vaisseau.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Étape 3 : Caractérisation du vaisseau

Le matériau choisi est le chitosane, produit à partir de la chitine présente dans la carapace de crustacés tels la crevette ou le homard. Ce copolymère de N-acétylglucosamine et de glucosamine est connu, entre autres, comme supplément alimentaire. Mais, et c’est ce qui nous intéresse ici, il est aussi reconnu pour stimuler les mécanismes de défense des plantes et inhiber la croissance de plusieurs champignons pathogènes. Parfait pour protéger les passagers comme l’hostilité de l’environnement.

Le principe de la fabrication du vaisseau est simple, mais ingénieux. Le chitosane en solution légèrement acide est de charge positive. En présence d’un polyphosphate de charge négative, un polymère se forme. Un peu comme la formation des os dans l’organisme, mais en plus simple. Donc, on mélange les spores dans une solution de chitosane, et on laisse tomber de petites gouttes de ce mélange dans une solution de polyphosphate. Au contact avec de la solution, une bille se forme. Pour déterminer sa taille, il suffit de jouer avec la concentration de chitosane, le volume de la goutte et la hauteur de chute.

Les billes sont par la suite lavées dans de l’eau stérile, puis l’eau est retirée par lyophilisation. Les spores sont maintenant encapsulées dans le chitosane. Regardons de plus près la morphologie de ces billes :

• FIGURE 3A : Surface du véhicule. On note des ouvertures qui seront utiles lors de la réhydratation, quand on voudra faire « revivre » les spores. De plus, les irrégularités laissant supposer une structure interne complexe.
• FIGURE 3B : Coupe d’une bille dont on voit la structure interne très complexe qui ressemble à de l’os

 

 

Pour savoir maintenant où se logent les spores, on utilise le microscope électronique à balayage environnemental (MEBE). De plus, cette microscopie « environnementale » rend possible l’examen de l’échantillon sans le métalliser (en microscopie à balayage standard, on métallise l’échantillon pour le rendre conducteur et y faire rebondir les électrons), ce qui permet de s’assurer qu’aucun artéfact ne vient fausser les observations.

La FIGURE 4 montre la surface ces billes non métallisées, et sur cette surface, on y aperçoit des spores. Mais les spores sont-elles aussi présentes à l’intérieur de la bille?

L’enquête se poursuit donc. La FIGURE 5 illustre les résultats obtenus sur des coupes à main levée de billes examinées avec différents éclairages en microscopie optique. Les spores sont bien à l’intérieur de la structure.

• A : Examen à fond noir. Les petits points blancs sont des spores trappées dans la structure de la bille.
• B : Image en contraste de phase où les spores apparaissent en noir
• C et D : Images en contraste interférentiel.  La majorité des spores se retrouvent à l’intérieur de la structure du vaisseau.
• E et F : Coupes d’un micromètre colorées au bleu de toluidine. Les flèches pointent vers des spores et des agrégats de spores.

Étape 4 : État des passagers du vaisseau spécial

Maintenant que nous avons caractérisé le vaisseau, la question qui nous vient est la suivante : dans quel état se trouvent les passagers « entrappés » dans la structure du vaisseau? Plus précisément, est-ce que le vaisseau est devenu leur tombeau?

Nous avons mis les billes en culture, puis nous les avons analysées toutes les 24 heures par microscopie confocale après une coloration LIVE/DEAD ®. Le microscope confocal fonctionne avec des lasers dont le faisceau balaie l’échantillon à une épaisseur et un endroit déterminés. Ceci permet d’examiner la structure en entier et de la reconstituer en trois dimensions.

• Après 48 heures : apparition de très petits points verts à  la surface de la bille
• Après 96 heures : apparition de micro-colonies (FIGURE 6)

Ces colonies d’un vert éclatant nous informent que nos passagers sont, comme on dit en bon Québécois, « pétants de santé ». Vigoureuse, chacune de ces colonies émerge de la multiplication  d’une seule spore.

• Après 168 heures, les passagers explosent de toutes parts (FIGURE 7).

Les passagers se portent donc très bien,, mais qu'arrive-til une fois que le vaisseau complètement détruit?

 

 

Dispersion du vaisseau

Rendue à destination, l’eau pénètre dans le vaisseau par les pores et réhydrate les spores, qui ont retrouvé leur forme de bactérie filamenteuse et qui se sont divisées pour former des colonies. Une fois redevenues actives, les bactéries utilisent le chitosane du vaisseau comme substrat grâce à un enzyme nommé chitosanase. Autrement dit, elles « bouffent » le vaisseau.

Puis, les microcolonies se dispersent dans leur nouvel environnement. Par leur forme particulière (FIGURE 8), elles se multiplieront dans le sol ou sur la plante à protéger.

Les avantages de l’utilisation d’un tel vaisseau sont indéniables. Le chitosane trappe les spores dans sa structure et les conserve à la température de la pièce. De plus, le vaisseau est un véritable cheval de Troie permettant d’introduire de nouvelles bactéries dans un environnement très peu accueillant. Au niveau du sol, on retrouve autant de microorganismes qu’un ciel étoilé, luttant les uns contre les autres pour tirer le maximum de profit de leur milieu. À l’atterrissage du vaisseau, le chitosane protège les spores physiquement et chimiquement, mais surtout, il les met à l’abri des champignons par ses propriétés inhibitrices. Autre point très important, le chitosane permet aux bactéries de survivre en servant de substrat, soit de nourriture. Une fois bien établies dans leur nouvel environnement, les bactéries protègent la plante-cible par des échanges de métabolites. Une forme de relation symbiotique s’établit alors entre la plante et la bactérie.

 

 

Conclusion

Dans cet article, nous vous avons démontré avec la preuve par l’image en quoi consiste le travail d’un microscopiste. Nous avons caractérisé le vaisseau et démontré qu’il ne s’agissait pas d’une simple capsule, mais d’une structure complexe. Nous vous avons montré ce qui arrivait des passagers et surtout où ils étaient logés dans la capsule. On dit souvent qu’une image vaut mille mots et je crois que cet article en est la preuve. On dit aussi que les microscopistes sont les yeux de la science, et j’espère que c’est ce que j’aurai fait bien « voir ». En espérant que cet article stimule les jeunes à se diriger vers cette belle profession, celle de microscopiste.

• L’équipe Beaulieu : Ces travaux sont réalisés sous la gouverne de la Dre Carole Beaulieu en collaboration avec plusieurs de ses étudiants diplômés ainsi que des membres de son personnel de recherche. Professeure titulaire au Département de biologie de l’Université de Sherbrooke, Carole Beaulieu coordonne aussi le Centre SÈVE, qui réalise des recherches en sciences du végétal. Une partie de ses travaux concerne la lutte biologique contre des agents phytopathogènes – en d’autres mots, l’étude des agents de lutte biologique qui protègent les cultures végétales contre différents organismes pathogènes.